阮濤，吳莉，劉岐煥，王季石

(1.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北 十堰 442008；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004)

NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTL)是血液及淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，是一種特殊且具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，進(jìn)展迅速且惡性程度極高[1]。在2016年WHO惡性淋巴瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)中，NK/T細(xì)胞淋巴瘤被命名為結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤(ENKTL)。目前研究顯示[2-3]，以門冬酰胺酶(L-ASP)為基礎(chǔ)的化療方案[如甲氨蝶呤+異環(huán)磷酰胺+左旋門冬酰胺酶+依托泊苷(SMILE)方案]用于進(jìn)展期ENKTL患者效果較好，其近期療效以及遠(yuǎn)期的生存率均優(yōu)于傳統(tǒng)的環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松(CHOP)方案；含培門冬酶的方案[如吉西他濱+奧沙利鉑+培門冬酶(P-Gemox)方案]對于Ⅲ/Ⅳ期及難治復(fù)發(fā)的ENKTL療效較好，安全性較高[4]。也有報道[5-6]顯示，以吉西他濱(GEM)為基礎(chǔ)的方案，尤其是GDP(順鉑、吉西他濱、地塞米松)方案，患者耐受性可，能夠取得較好療效。2016年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[7]和2018年淋巴瘤診療規(guī)范中均推薦GDP方案作為晚期ENKTL的一線治療方案。GDP方案主要是吉西他濱、順鉑、地塞米松三種藥物組合的化療方案。吉西他濱為細(xì)胞周期特異性的脫氧胞苷類似物，作用在DNA的合成期(S期)；順鉑(DDP)為首個鉑類藥物，是一種廣譜且高效抗癌藥，但易造成一系列的毒性反應(yīng)，其中腎毒性最為嚴(yán)重[8]。卡鉑(CBP)為二代鉑類，其與順鉑均為細(xì)胞周期的非特異性藥物，非血液系統(tǒng)毒性(如耳、腎、神經(jīng)毒性)較DDP低。目前國內(nèi)外對卡鉑的研究不斷增加，在一些實(shí)體腫瘤中其抗腫瘤活性與順鉑相當(dāng)，預(yù)測其在臨床化療中可能會有更大的空間[9-11]。目前吉西他濱聯(lián)合卡鉑用于治療ENKTL的研究未見類似報道，因此本實(shí)驗(yàn)以卡鉑替換順鉑，旨在探討吉西他濱聯(lián)合卡鉑對ENKTL細(xì)胞株SNK 6細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制，為尋找低毒、高效的ENKTL化療方案提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(SNK 6)為本課題組長期保存；吉西他濱購于豪森藥業(yè)有限公司，卡鉑、順鉑購于齊魯制藥科技公司；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于Hyclone公司，二甲基亞砜(DMSO)購于北京索寶萊公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測法(CCK-8)試劑盒購于日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白定量、PVDF膜試劑購于碧云天生物技術(shù)研究所；一抗[甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，Cleaved-Caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)]和二抗(羊抗兔)購于CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮瓶中快速取出實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞(SNK 6細(xì)胞)，將細(xì)胞重懸并接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)入5% CO2，37 ℃，濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞均勻貼壁生長，隔天進(jìn)行細(xì)胞換液，使用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2 次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

選取吉西他濱分別與卡鉑和順鉑做聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，用金式公式計(jì)算其聯(lián)合用藥的Q值。金式公式：Q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb)。公式中的Ea為A藥單用的抑制率，Eb為B藥單用的抑制率，Ea+b為兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制率。Q值>1.15表示兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用，Q值為0.85～1.15提示兩藥聯(lián)合具有相加作用，Q<0.85提示兩藥聯(lián)合具有拮抗作用。按試驗(yàn)需求設(shè)置分組：空白對照組、吉西他濱組、吉西他濱+卡鉑組、吉西他濱+順鉑組。采用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡法(Western Bloting)檢測細(xì)胞凋亡率與凋亡蛋白表達(dá)。

1.4 CCK-8法檢測藥物對SNK 6細(xì)胞增殖的影響

用移液器輕柔吹打收集的處于對數(shù)期的SNK 6細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×103個/mL，以每孔100 μL懸液接種于96孔板，設(shè)5個復(fù)孔，按設(shè)定的藥物濃度處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中分別孵育48 h；培養(yǎng)結(jié)束后向各孔再輕柔加入10 μL CCK-8溶液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中再孵育4 h；而后采用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測各孔的吸光度(OD值)，重復(fù)3次。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞抑制率，公式為：抑制率=(1-加藥孔OD值/對照孔OD值)×100%。應(yīng)用SPSS軟件算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。采用金氏公式判斷吉西他濱與卡鉑組和吉西他濱與順鉑組聯(lián)合用藥的性質(zhì)。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測凋亡率。收集對數(shù)期生長的SNK 6細(xì)胞，于96孔板中緩慢加入細(xì)胞懸液，每孔2 mL，加入上述4組藥物，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中孵育48 h后收集細(xì)胞，離心5 min后倒去上層清液；用PBS洗滌SNK 6細(xì)胞2次，再次離心后棄掉上層液體收集沉淀；以1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。分別向上述4組細(xì)胞懸液中逐滴緩慢加入5 μL Annexin V-FITC染液，冰上避光孵育15 min后，加10 μL碘化丙啶染色液(PI)混勻，避光且于4 ℃下孵育5 min；最后加400 μL 1×Binding Buffer；在60 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測凋亡蛋白的表達(dá)

提取各組細(xì)胞的蛋白，通過電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、一抗4 ℃搖床孵育16 h、二抗室溫孵育1 h、洗膜、在蛋白免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)液中于凝膠成像系統(tǒng)下曝光，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 三種藥物單用對SNK 6細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)藥物終濃度(即藥物在體內(nèi)血漿峰濃度的1/10)的不同比例以及預(yù)實(shí)驗(yàn)(藥物敏感實(shí)驗(yàn))的結(jié)果來設(shè)定吉西他濱、卡鉑、順鉑三種藥物的不同濃度梯度，采用CCK-8法分別檢測上述三種藥物對SNK 6細(xì)胞的抑制作用，用細(xì)胞抑制率與劑量對數(shù)作圖，并求出各自IC50值。結(jié)果提示：與空白對照組比較，不同濃度的吉西他濱、卡鉑、順鉑作用于培養(yǎng)48 h的SNK 6細(xì)胞均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，對SNK 6細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴效應(yīng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。吉西他濱、卡鉑和順鉑的IC50分別為(0.001 7±0.000 3) μg/mL，(10.44±1.23) μg/mL，(5.75±0.51) μg/mL(見表1和圖1)。

表1 不同濃度藥物單用對SNK 6細(xì)胞的抑制率

圖1 吉西他濱和卡鉑及順鉑對SNK 6細(xì)胞的抑制率

2.2 吉西他濱聯(lián)合卡鉑或順鉑對SNK 6細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)2.1結(jié)果，用不同濃度吉西他濱分別與順鉑和卡鉑做聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，即0.000 1 μg/mL吉西他濱+5.75 μg/mL順鉑或10.44 μg/mL卡鉑，以及0.001 7 μg/mL吉西他濱+5.75 μg/mL順鉑或10.44 μg/mL卡鉑，通過計(jì)算出Q值判斷吉西他濱與卡鉑和吉西他濱與順鉑聯(lián)合用藥的性質(zhì)。結(jié)果顯示，在較低濃度吉西他濱(0.000 1 μg/mL)與卡鉑和順鉑的聯(lián)合用藥中，吉西他濱+卡鉑組和吉西他濱+順鉑組對SNK 6細(xì)胞的抑制率與吉西他濱相比明顯增高(P<0.05)，兩者聯(lián)合為相加作用。吉西他濱+卡鉑組對細(xì)胞的抑制率略低于吉西他濱+順鉑組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明其對SNK 6細(xì)胞抑制率相當(dāng)，且兩藥聯(lián)合仍為相加作用(見表2)。

2.3 吉西他濱聯(lián)合卡鉑或順鉑對SNK 6細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 細(xì)胞凋亡率檢測

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)提示吉西他濱聯(lián)合卡鉑對SNK 6細(xì)胞有抑制作用，吉西他濱+卡鉑與吉西他濱+順鉑對SNK 6細(xì)胞抑制作用相當(dāng)，進(jìn)一步檢測其對SNK 6細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：空白對照組、吉西他濱組、吉西他濱+卡鉑組、吉西他濱+順鉑組凋亡率依次為：(4.39±1.06)%，(24.30±2.64)%，(47.11±1.98)%和(51.41±2.15)%。吉西他濱組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)，吉西他濱+卡鉑組、吉西他濱+順鉑組均高于吉西他濱組和空白對照組(P<0.05)，而吉西他濱+卡鉑組細(xì)胞凋亡率稍低于吉西他濱+順鉑組，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。

a為空白對照組；b為吉西他濱組；c為吉西他濱+卡鉑組；d為吉西他濱+順鉑組；e為四組的凋亡率比較；*表示吉西他濱組和吉西他濱+卡鉑組與空白對照組相比，P<0.05圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

2.3.2 凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

為了進(jìn)一步探索吉西他濱聯(lián)合卡鉑誘導(dǎo)SNK 6細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，用Western Blotting法檢測上述四組Cleaved-caspase-3，Bcl-2，Bax等凋亡蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與空白對照組相比，吉西他濱可下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)Cleaved-caspase-3蛋白、Bax蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。與吉西他濱組比較，吉西他濱與卡鉑或順鉑聯(lián)合時效果更加顯著(P<0.05)，吉西他濱+順鉑組效果稍強(qiáng)于吉西他濱+卡鉑組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

3 討 論

ENKTL有其獨(dú)特的生物學(xué)及臨床表現(xiàn)，Ⅰ期/Ⅱ期ENKTL患者可考慮放療或化療聯(lián)合治療，Ⅲ/Ⅳ期可采用以L-ASP為基礎(chǔ)的化療和造血干細(xì)胞移植。目前GDP方案被推薦為治療晚期ENKTL的一線方案?？ㄣK腎毒性較順鉑低，可替換順鉑用于許多癌癥的化療，但卡鉑并不是在所有腫瘤中都具有類似順鉑的效應(yīng)。目前吉西他濱聯(lián)合卡鉑用于治療ENKTL的研究未見類似報道。因此，本實(shí)驗(yàn)以卡鉑替換順鉑，采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blotting法來探討卡鉑聯(lián)合吉西他濱對SNK 6細(xì)胞的凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的不斷增加，對SNK 6細(xì)胞的抑制率不斷增強(qiáng)，有明顯的劑量依賴效應(yīng)。吉西他濱對SNK 6細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，與國外報道相一致[12-13]。本實(shí)驗(yàn)卡鉑對SNK 6細(xì)胞的抑制作用低于順鉑。回顧性研究[14]表明，卡鉑是不依賴耐藥基因MDR-1的藥物，對ENKTL有較好的效果，而在本研究中，卡鉑單用對SNK 6細(xì)胞抑制效果低于順鉑，這可能與惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外生長存在特異性差異有關(guān)系。同時，卡鉑以聯(lián)羧基環(huán)丁烷取代順鉑結(jié)構(gòu)中的氯離子配體，與DNA交聯(lián)作用較為緩慢，是導(dǎo)致其藥理作用和毒副作用差異的關(guān)鍵因素[15]。

#表示吉西他濱組與空白對照組相比，P<0.05；*表示吉西他濱+卡鉑組和吉西他濱+順鉑組與吉西他濱組相比，P<0.05圖3 Western Blotting檢測各組凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)結(jié)果

本研究結(jié)果顯示，吉西他濱+卡鉑組對細(xì)胞的抑制率略低于吉西他濱+順鉑組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合用藥中，卡鉑、順鉑分別與吉西他濱聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)其對SNK 6細(xì)胞的抑制作用相當(dāng)，這可能與吉西他濱和卡鉑聯(lián)合應(yīng)用時具有相加作用有關(guān)。有報道顯示[16]吉西他濱可通過促進(jìn)DNA合成以及修復(fù)來加強(qiáng)卡鉑的細(xì)胞毒性；卡鉑同時能提高吉西他濱導(dǎo)致DNA鏈變性的作用，提示二者聯(lián)合可以增強(qiáng)藥物的療效。同時有研究[17-19]顯示，吉西他濱聯(lián)合卡鉑用于治療宮頸癌、尿路上皮癌、非小細(xì)胞肺癌均有一定效果，但二者聯(lián)合治療ENKTL卻未見類似報道。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)來檢測凋亡率，其結(jié)果提示：吉西他濱聯(lián)合卡鉑或順鉑的凋亡率均高于吉西他濱組和空白對照組，而吉西他濱+卡鉑組細(xì)胞凋亡率稍低于吉西他濱+順鉑組，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果與CCK 8法結(jié)果一致，提示卡鉑聯(lián)合吉西他濱可誘導(dǎo)SNK 6細(xì)胞凋亡，且卡鉑、順鉑分別與吉西他濱聯(lián)合時對SNK 6細(xì)胞凋亡作用相當(dāng)。有研究顯示，吉西他濱可有效促進(jìn)與Cleaved-Caspase-3相關(guān)的凋亡通路的激活，對特定蛋白底物水解進(jìn)行有效抑制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)Western Blot結(jié)果提示：與空白對照組相比，吉西他濱通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，使Bax/Bc1-2升高，從而上調(diào)cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)。吉西他濱與卡鉑和順鉑聯(lián)合時蛋白表達(dá)趨勢更為顯著，且吉西他濱+卡鉑組稍低于吉西他濱+順鉑組，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而推測吉西他濱、卡鉑可能是通過線粒體途徑促進(jìn)SNK 6細(xì)胞發(fā)生凋亡。但細(xì)胞凋亡過程較為復(fù)雜，凋亡基因之間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系有待利用其他方法進(jìn)一步研究。

綜上，吉西他濱聯(lián)合卡鉑可誘導(dǎo)SNK 6細(xì)胞發(fā)生凋亡，其可能機(jī)制是通過線粒體途徑發(fā)生凋亡，且一定濃度下的卡鉑或順鉑聯(lián)合吉西他濱對SNK 6增殖及凋亡作用相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)提示：吉西他濱聯(lián)合卡鉑在一定濃度條件下或許可以替換吉西他濱聯(lián)合順鉑用于ENKTL的化療，尤其在因順鉑的腎毒性嚴(yán)重而無法使用順鉑時，卡鉑與吉西他濱聯(lián)用可能更具優(yōu)勢。但本實(shí)驗(yàn)不足之處在于細(xì)胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境與腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長環(huán)境不完全相同，藥物敏感實(shí)驗(yàn)僅反映部分腫瘤細(xì)胞的凋亡率，只能反映腫瘤生長的某一個階段，并不能完全體現(xiàn)藥物-人體-腫瘤的關(guān)系，有待后續(xù)進(jìn)行相應(yīng)的動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)深入探討。