烏吉斯古楞 張彤

胰腺癌是一種常見的侵襲性惡性腫瘤，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。在過去的幾十年中，胰腺癌的臨床結(jié)局并沒有顯著改善，平均存活率是5%[2]。吉西他濱是最常用的抗胰腺癌藥物之一，然而目前的抗胰腺癌療法仍不令人滿意。研究表明，B7-H3基因的沉默聯(lián)合吉西他濱能夠抑制人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu8988t生長[3]。分泌磷蛋白1(secreted phosphoprotein-1，SPP1)具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的作用，下調(diào)SPP1導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗性[4]。SPP1在宮頸癌組織和細(xì)胞系中過表達(dá)，SPP1的下調(diào)可抑制HeLa細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增加順鉑的化學(xué)敏感性[5]。然而沉默SPP1聯(lián)合吉西他濱在胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡中的作用目前仍未可知。基于此，本研究利用小干擾RNA技術(shù)沉默SPP1表達(dá)，探討沉默SPP1聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，吉西他濱購自美國禮來公司，si-con、si-SPP1購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting Kit-8，CCK-8)購自日本Dojindo公司，抗SPP1、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，c-Caspase-3)、P糖蛋白(P-glucoprotein，Pgp)、MDR1、β肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗購自英國Abcam公司，碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自美國Sigma-Aldrich公司，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中，其中包含10%胎牛血清、1.5 mmol/L左旋谷氨酸、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中生長。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 收集對數(shù)生長期的胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞，接種在6孔板中，每孔1×105個細(xì)胞，融合至70%左右時，利用Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑將si-con、si-SPP1轉(zhuǎn)染PaTu 8988t細(xì)胞。將PaTu 8988t細(xì)胞分為空白組(未經(jīng)任何處理)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-SPP1組(轉(zhuǎn)染si-SPP1)、吉西他濱組(吉西他濱處理)、si-SPP1+吉西他濱組(轉(zhuǎn)染si-SPP1和吉西他濱處理)。其中，轉(zhuǎn)染時間為24 h，吉西他濱濃度為20 μmol/L[6]，作用時間為24 h。

1.4 qPCR檢測SPP1 mRNA表達(dá) 根據(jù)TRIzol試劑說明書的指導(dǎo)進(jìn)行PaTu 8988t細(xì)胞中RNA分離。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物由上海生工公司合成，如下：SPP1 5’-TTTGTTGTAAAGCTGCTTTTCCTC-3’(正向)和5’-GAATTGCAGTGATTTGCTTTTGC-3’(反向)，內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’(正向)和5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’(反向)。qPCR遵循TaqMan基因表達(dá)檢測方案進(jìn)行。根據(jù)2-ΔΔCt計算SPP1 mRNA表達(dá)。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將PaTu 8988t細(xì)胞接種到96孔板，每孔3×105個細(xì)胞，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別孵育24 h、48 h、72 h。之后根據(jù)CCK-8檢測試劑盒說明書，每孔加入CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測孵育4 h后的吸光度(A)值，檢測波長為450 nm。

1.6 Western blot檢測SPP1、CyclinD1、c-Caspase-3、Pgp和MDR1蛋白表達(dá) 使用RIPA緩沖液中提取PaTu 8988t細(xì)胞的蛋白，經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒定量后，進(jìn)行10%的SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉，1 h后將SPP1、CyclinD1、c-Caspase-3、Pgp、MDR1和參照β-actin(1∶1 000 稀釋)與膜4℃孵育過夜。次日，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒和來分析SPP1、CyclinD1、c-Caspase-3、Pgp和MDR1蛋白表達(dá)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 根據(jù)Bundscherer等[7]的方法進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，收集1×106個細(xì)胞，室溫下用無水乙醇固定30 min，加入1 mg/ml RNase A，孵育30 min后，加入100 μg/ml PI，通過流式細(xì)胞儀分析G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量。

1.8 Annexin V染色分析細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒的說明書來檢測細(xì)胞凋亡，將PaTu 8988t細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液之中，濃度為1×106個細(xì)胞/ml。將5 μl FITC和5 μl PI添加到100 μl細(xì)胞懸液中，然后在黑暗中孵育15 min，加入400 μl的結(jié)合緩沖液，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞沉默SPP1基因效率檢測 qPCR和Western blot檢測結(jié)果表明，與空白組比較，si-SPP1組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞中SPP1 mRNA和SPP1蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 沉默SPP1基因后胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞中SPP1 mRNA和SPP1蛋白

圖1 Western blot檢測沉默SPP1基因后胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞中SPP1蛋白表達(dá)

2.2 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測顯示，與si-con組比較，si-SPP1組和吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與si-SPP1組或吉西他濱組比較，si-SPP1+吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞活力的影響

2.3 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞周期的影響 對CyclinD1蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期的檢測結(jié)果表明，與si-con組比較，si-SPP1組和吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞的CyclinD1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞百分比明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比顯著減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞百分比無明顯變化(P>0.05)；與si-SPP1組或吉西他濱組比較，si-SPP1+吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞的CyclinD1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞百分比明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比顯著減少(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞百分比無明顯變化(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western blot檢測沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞CyclinD1蛋白的表達(dá)

表3 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞周期和CyclinD1蛋白表達(dá)的影響

2.4 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響 對c-Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-con組相比較，si-SPP1組和吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞的c-Caspase-3蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與si-SPP1組或吉西他濱組相比較，si-SPP1+吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞的c-Caspase-3蛋白水平和細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞凋亡和c-Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western blot檢測沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞c-Caspase-3蛋白的表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；A Western blot檢測沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞c-Caspase-3蛋白的表達(dá);B 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

2.5 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞Pgp和MDR1蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果表明，與si-con組比較，si-SPP1組和吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞中Pgp和MDR1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)；與si-SPP1組或吉西他濱組比較，si-SPP1+吉西他濱組胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞的Pgp和MDR1蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞Pgp和MDR1蛋白表達(dá)的影響

圖4 Western blot檢測沉默SPP1基因聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞Pgp和MDR1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，預(yù)后仍然不佳。胰腺的解剖位置與許多重要器官、主動脈和靜脈密切相關(guān)。因此，大部分胰腺癌患者(80%～85%)存在鄰近器官或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，需要手術(shù)切除[8]。目前，核苷類似物吉西他濱被推薦為治療晚期胰腺癌的一線藥物[9]。吉西他濱可作為單一藥物或與其他化療藥物聯(lián)合使用來治療胰腺癌，但由于耐藥性的出現(xiàn)，其成功率很低[10]。因此，迫切需要發(fā)展針對胰腺癌的化學(xué)療法。本研究評估沉默SPP1聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)二者在胰腺癌細(xì)胞中具有抗增殖，阻滯周期和誘導(dǎo)凋亡活性，值得注意的是，沉默SPP1與吉西他濱聯(lián)用的效果更顯著。表明沉默SPP1與吉西他濱聯(lián)合使用可能是針對這種胰腺癌的有效聯(lián)合治療方案。

SPP1也被稱為骨橋蛋白，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與生物礦化和鈣化的控制[11-13]。SPP1由6個內(nèi)含子和7個外顯子組成，編碼在4號染色體上(4q13)[14]，可從各種類型的細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞)中分泌出來[15]。SPP1涉及多個生理和病理過程，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中與細(xì)胞生長、粘附和侵襲顯著相關(guān)。SPP1在多種癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。在一項(xiàng)關(guān)于卵巢癌的研究中，發(fā)現(xiàn)SPP1在卵巢癌組織中高表達(dá)并促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展[16]。Pio等報道了SPP1在乳腺癌細(xì)胞中被上調(diào)，并通過激活WNK-1和pras40相關(guān)通路促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和干細(xì)胞樣行為[17]，SPP1在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中也有過表達(dá)，且與預(yù)后不良有關(guān)[18,19]。上述研究表明，SPP1可能是人類癌癥潛在的生物標(biāo)志物或新的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默SPP1明顯降低胰腺癌PaTu 8988t細(xì)胞的細(xì)胞活力、CyclinD1表達(dá)和S期細(xì)胞百分比，顯著提高c-Caspase-3蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞百分比，而對G2/M期細(xì)胞百分比無明顯影響，表明沉默SPP1具有抗胰腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，與單獨(dú)使用吉西他濱的作用效果相同，而二者聯(lián)用的效果顯著優(yōu)于沉默SPP1或吉西他濱單獨(dú)使用。

吉西他濱對胰腺癌的治療作用已被廣泛證明，然而吉西他濱發(fā)揮作用的分子基礎(chǔ)研究尚不充分[20]。Pgp和MDR1是多藥耐藥基因，在腫瘤的多藥耐藥中起著重要作用[21]。MDR1廣泛表達(dá)，可能是人類處理藥物最重要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，已被確定為多藥耐藥性的主要原因。Pgp是由1 280個氨基酸組成的170-kDa ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是由人類MDR1基因編碼的能量依賴性藥物流出泵[22]。根據(jù)報道，阿爾及利亞蜂膠通過抑制Pgp活性，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯，來增強(qiáng)阿霉素介導(dǎo)的抗人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的抗癌作用[23]。MDR1的過表達(dá)有助于增強(qiáng)了膽囊癌細(xì)胞對吉西他濱的化學(xué)耐藥性，而微小RNA(microRNA，miR)-218-5p通過消除PRKCE誘導(dǎo)的MDR1/Pgp上調(diào)來改善吉西他濱的療效[24]。本實(shí)驗(yàn)中，沉默SPP1和吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合使用均顯著降低PaTu 8988t細(xì)胞的Pgp和MDR1蛋白表達(dá)量，提示抑制Pgp和MDR1蛋白表達(dá)可能是二者在胰腺癌中發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑。

綜上所述，沉默SPP1或吉西他濱可以明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，二者聯(lián)用的效果更優(yōu)，其作用機(jī)制與抑制Pgp和MDR1蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究也表明，沉默SPP1基因與吉西他濱聯(lián)合使用似乎是治療胰腺癌患者的一種有吸引力的選擇。