何玲玲 孫亮亮 俞曉雲(yún) 李睿彥 王海琳

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是全球女性最具威脅生命的惡性腫瘤之一，在女性常見惡性腫瘤中位居第七，癌癥相關死亡中位居第八位，5年生存率低于45%[1]。由于卵巢位于骨盆內，位置隱匿，早期無癥狀，導致大多患者確診時為晚期，即使初診時行手術治療聯(lián)合足療程化療，多數(shù)患者仍在兩年內復發(fā)，復發(fā)患者由于經(jīng)歷多次化療而對化療藥物耐藥是導致治療失敗的主要原因[2]?；熌退幣c細胞信號通路在分子水平上的激活有關，明確OC耐藥發(fā)生的分子機制并進行靶向干預，可能是克服OC耐藥并改善患者預后的有效途徑。外泌體(Exosomes)是由多種細胞分泌的具有脂質雙層膜結構的微囊，大小在40～150 nm[3]。外泌體含有多種生物活性物質，如核酸、蛋白質和脂質，它通過釋放生物活性物質，與受體細胞膜融合或細胞表面受體結合，在細胞間的信息交流中起著重要作用。研究表明，外泌體與多種腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中細胞間化療耐藥的傳遞過程有關，如乳腺癌、前列腺癌、OC等[4]。外泌體參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響腫瘤的耐藥性，在臨床上具有作為腫瘤標志物、治療靶點及藥物納米載體的潛在臨床應用價值[5]。本文綜述外泌體參與OC耐藥的機制及其在靶向治療中的價值，為今后OC靶向治療的研究提供新思路。

1 外泌體與OC

卵巢腫瘤細胞及其微環(huán)境均與腫瘤的進展和轉移密切相關。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞與非腫瘤細胞、細胞外基質、細胞因子及胞外囊泡組成。缺氧是促進上皮性腫瘤擴散的關鍵因素。卵巢腫瘤本質上處于缺氧微環(huán)境中，缺氧可以通過上調Rab27a、下調Rab7、溶酶體相關膜蛋白1和2(LAMP1/2)、神經(jīng)氨酸酶(NEU1)以及促進溶酶體的分泌表型增加卵巢癌外泌體的釋放[6]。存在于OC微環(huán)境中的外泌體通過與受體細胞膜相互作用參與OC的發(fā)生發(fā)展、轉移、免疫反應和化療耐藥[7]。

1.1 外泌體調控腫瘤微環(huán)境 OC不同于其他惡性腫瘤的是具有一個特定的腫瘤微環(huán)境，腹水在OC擴散中起著重要作用[8]。>1/3的OC患者確診時伴有腹水，幾乎復發(fā)患者均有腹水[9]。惡性腹水富含細胞因子、生長因子及各種促炎和免疫抑制因子，共同形成促進腫瘤生長的微環(huán)境，并介導對化療藥物的耐藥[10]。腹水中的外泌體通過信號轉導在此過程中發(fā)揮了關鍵作用。Cho等[11]證明OC來源的外泌體可以誘導脂肪間充質干細胞(adipose mesenchymal stem cells，AMSC)表現(xiàn)出腫瘤相關成纖維細胞(CAF)的典型特征，并通過增加轉化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)的分泌激活SMAD依賴性途徑和非SMAD依賴性途徑從而促進腫瘤進展及侵襲。此外，外泌體中的miRNA通過調節(jié)基因表達在OC進展中發(fā)揮作用。OC來源的外泌體可以將miR-222-3p轉移到巨噬細胞，通過SOCS3/STAT3通路誘導腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMS)產(chǎn)生,促進OC細胞增殖、血管生成、免疫抑制、侵襲及轉移[12,13]。總之，OC來源的外泌體參與腫瘤微環(huán)境的調控，從而促進腫瘤進展。

1.2 外泌體調節(jié)腫瘤免疫反應 腫瘤細胞與免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中的動態(tài)相互作用參與了OC化療耐藥及腫瘤進展。腫瘤來源的外泌體通過幾種不同的機制抑制免疫系統(tǒng)。腹水來源的外泌體可被單核細胞攝取，激活TOLL樣受體(TLR)依賴的信號通路，誘導IL-1β、TNF-α、IL-6等細胞因子分泌增加，從而導致免疫抑制[14]。此外，腫瘤來源的外泌體可以促進免疫抑制性細胞的分化來增強免疫抑制，包括骨髓源性抑制細胞(MDSC)、TAMS和調節(jié)性T細胞(Tregs)。MDSC可以負性調控抗原的加工和呈遞，促進免疫抑制因子的分泌，抑制免疫應答[15,16]。外泌體還可通過Fas/FasL誘導T細胞凋亡或通過NKG2D配體下調NK細胞活性[17,18]。外泌體對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的調節(jié)是相當復雜的，了解它們相互作用的機制能為腫瘤的治療提供一種新視野。

2 外泌體參與OC耐藥的機制

目前，化療耐藥是腫瘤治療面臨的主要挑戰(zhàn)，闡明腫瘤發(fā)生和耐藥的分子機制對研究腫瘤治療新策略至關重要。外泌體參與OC耐藥的機制包括傳遞耐藥相關miRNA至受體細胞調節(jié)基因表達、通過藥物轉運蛋白減少細胞內藥物濃度和誘導上皮-間質轉化(EMT)來誘導化療耐藥。

2.1 外泌體通過轉移耐藥相關miRNA誘導OC耐藥 近年來外泌體中的microRNA(miRNA) 在OC耐藥中的作用備受關注。miRNA是由19-25個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，能調節(jié)靶基因的轉錄后沉默，在OC耐藥中發(fā)揮重要作用。外泌體在細胞間傳遞耐藥相關miRNA誘導化療耐藥。Au Yeung等[19]研究表明癌癥相關脂肪細胞(CAA)和CAF來源的外泌體高度表達miR-21,并通過抑制凋亡蛋白酶激活因子1(AFAP1)抑制OC細胞凋亡，并且通過靶向TGF信號通路間接上調基質金屬蛋白酶1(MMP-1)，這可能導致OC細胞侵襲能力增加，誘導OC細胞化療耐藥。研究表明，缺氧的OC細胞引導巨噬細胞募集并誘導其成為TAM樣表型，它釋放的外泌體富含miR-233,并可轉移到共培養(yǎng)的OC細胞中，同時增強腫瘤細胞的耐藥性及惡性表型，miR-233在體內外均通過PTEN-PI3K/AKT途徑促進OC細胞的耐藥性，并且外周循環(huán)中miR-233 的水平與OC的復發(fā)密切相關[20]。此外，OC細胞表達的miR-433通過下調細胞周期蛋白依賴性激酶6(CKD6)和誘導細胞衰老來促進OC細胞對紫杉醇的耐藥性[21]。Guo等[22]研究表明CAF分泌的外泌體富含miR98-5p,它可以通過靶向抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)的表達抑制細胞凋亡，并介導OC細胞對順鉑的耐藥性。當然，外泌體中的某些microRNA能夠降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。Liu等[23]研究表明對順鉑耐藥的OC細胞來源的外泌體中的miR-30a-5p在體內外均能通過下調SOX9表達，增加OC細胞的凋亡從而增強細胞對順鉑的敏感性，而耐藥OC細胞中的miR-30a-5p表達明顯降低，因此含有miR-30a-5p的外泌體可能是OC耐藥的一個新的治療靶點?？梢钥闯觯饷隗w中的miRNA對OC化療耐藥的調控是極其復雜的，除了上述miRNA外，外泌體中的其他miRNA也可能參與了OC的化療耐藥，需要進一步的實驗來闡明它們參與耐藥的分子機制。

2.2 外泌體通過輸出轉運蛋白誘導OC耐藥 外泌體中除了miRNA外還有多種蛋白質，已有研究證明蛋白質與OC耐藥的關系，提示外泌體可以通過輸出轉運蛋白來誘導OC耐藥。藥物代謝分子和某些蛋白質由腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體釋放到細胞外環(huán)境。Safaei等[24]的研究發(fā)現(xiàn)鉑耐藥的OC細胞釋放的外泌體中鉑含量是鉑敏感細胞的2.6倍，同時鉑耐藥細胞分泌的外泌體釋放更多的順鉑輸出轉運蛋白如耐藥相關蛋白2(MRP2)、銅離子轉出蛋白A(ATP7A)、銅離子轉出蛋白B(ATP7B)和LAMP1。通過蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)Ca2+和磷脂結合膜聯(lián)蛋白家族的成員Annexin a3在鉑耐藥OC細胞系中明顯增加，它可能通過阻止細胞對鉑的攝取或累積介導OC耐藥，Annexin a3的分泌可能與胞吐作用及外泌體的釋放有關，并且表達較高水平Annexin a3的OC細胞分泌更多的外泌體[25,26]。

P-糖蛋白(p-gp)是由多藥耐藥基因1(MDR-1)編碼的170 kDa的蛋白，參與多種腫瘤的耐藥。P-gp通過促進細胞內藥物的排出降低細胞內藥物濃度介導化療耐藥。Zhang等[27]研究表明在膜結合蛋白水平上，p-gp通過微囊的細胞間轉移實現(xiàn)在人OC細胞間“共享”。與野生型親本系相比(A2780/WT)相比，紫杉醇耐藥的人OC(A2780/PTX)更容易形成并釋放含有更多p-gp的微囊。微囊以時間和劑量依賴性方式與化療敏感的A2780/WT細胞結合，微囊介導的p-gp轉移致受體細胞(A2780/WT)對阿霉素和紫杉醇耐藥性均提高5倍。微囊和外泌體均屬于細胞外囊泡，外泌體p-gp已被證明可以誘導乳腺癌的耐藥，因此外泌體也可能通過轉移p-gp誘導OC耐藥[28]。此外，外泌體中也富含甲基轉移酶(DNMT1)，它在DNA復制和修復過程維持全基因組的甲基化中有著重要作用，DNA的甲基化通過調節(jié)基因表達參與腫瘤耐藥。Cao等[29]用順鉑處理SKOV3細胞，未暴露于外泌體的SKOV3細胞的凋亡率明顯高于暴露組，而外泌體抑制劑GW4869能恢復耐藥細胞的敏感性。綜上所述，腫瘤微環(huán)境中的外泌體可以通過攜帶各種輸出轉運蛋白誘導OC耐藥。

2.3 外泌體通過誘導EMT誘導OC耐藥 EMT是指從上皮細胞到間質細胞的轉化，EMT可賦予細胞轉移和侵襲的能力，包括獲得干細胞特征、減少細胞凋亡，促進免疫抑制。EMT是腫瘤免受細胞毒藥物作用的耐藥機制之一[30]。Crow等[31]用耐藥OC A2780的衍生細胞產(chǎn)生的外泌體處理A2780細胞,結果顯示上皮性標志物dystroglycan、E-cadherin和上皮細胞粘附分子(EpCAM)表達明顯下降，而間充質標志物paladin、TWIST、和Vimentian明顯上調。Li等[32]研究表明CAF分泌的外泌體中TGFβ1明顯上調，并通過激活SMAD信號通路促進卵巢腫瘤的EMT，增加OC的耐藥性及侵襲性。Yew等[33]研究發(fā)現(xiàn)表皮形態(tài)發(fā)生素(Epimorphin)可以逆轉OC的EMT,使OC細胞可以從間質表型轉化為上皮表型，從而增強對一線化療藥物的敏感性。總之，外泌體通過誘導腫瘤細胞產(chǎn)生EMT的細胞形態(tài)學特征參與OC化療耐藥，逆轉EMT可能可以提高OC細胞的敏感性。見圖1。

圖1 外泌體誘導OC耐藥的機制

3 外泌體在OC耐藥患者治療中的臨床價值

外泌體通過多種生物學機制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。隨著人們對外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用的了解，人們正在研究和開發(fā)外泌體在OC治療領域的應用，如調節(jié)外泌體的分泌、利用外泌體增強抗腫瘤免疫、利用外泌體的歸巢效應以及將外泌體作為運輸藥物的載體，這些研究為OC患者的治療帶來了新的希望。

3.1 調節(jié)外泌體的產(chǎn)生及釋放 外泌體與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關，在OC的治療中，有多種靶向外泌體或利用外泌體的選擇。近年來利用外泌體進行治療的研究主要集中在腫瘤微環(huán)境中細胞產(chǎn)生的外泌體的功能上。CAF來源的外泌體可以抑制OC胞凋亡并通過TGF信號通路促進OC細胞的侵襲、遷移和耐藥[19]，因此，抑制腫瘤微環(huán)境中CAF釋放外泌體可用于治療OC。研究表明，用腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導劑(TWEAK)處理的巨噬細胞來源的外泌體通過上調miR7的表達抑制OC受體細胞中EGFR/AKT/ERK1/2信號通路進而抑制OC的轉移，提示TWEAK刺激的巨噬細胞產(chǎn)生的外泌體miR7在OC的治療中有良好的應用前景[34]?？梢钥闯?，不同細胞來源的外泌體對腫瘤進展過程中的調節(jié)作用是不同的，調節(jié)腫瘤微環(huán)境中不同細胞分泌的外泌體釋放可能是治療OC的有效途徑。見表1。

表1 通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的外泌體治療OC的途徑

3.2 利用外泌體促進OC的治療

3.2.2 外泌體作為運輸藥物的載體:目前，化療仍然是治療腫瘤的主要方式。化療藥物的給藥方式和耐藥機制一直是腫瘤化療領域的研究熱點。過去開發(fā)的用于腫瘤治療的靶向藥物控釋系統(tǒng)，包括脂質體和納米顆粒聚合物，增加了給藥特異性，減少了藥物降解并延長了藥物釋放時間。但這些藥物運輸載體能引起嚴重副作用，包括器官毒性和免疫反應。化療耐藥是腫瘤患者的常見死亡原因。改進化療藥物的給藥方式和克服化療耐藥是治療腫瘤的關鍵方式。近年來，作為天然納米顆粒的外泌體被用作載有合成化學藥物或特定重組分子的藥物運輸載體。與現(xiàn)有藥物運輸載體相比，外泌體作為藥物運輸載體的優(yōu)勢是有較低的免疫原性和毒性，較高的循環(huán)和組織穩(wěn)定性以及固有的歸巢能力[43]。Zhang等[44]用臍帶血單核M1巨噬細胞來源的外泌體負載順鉑分別處理鉑敏感A2780細胞和鉑耐藥A2780/DDP細胞，結果顯示鉑敏感A2780細胞和鉑耐藥A2780/DDP細胞的細胞毒性作用分別提高1.4倍和3.3倍；用臍帶血M2來源的外泌體負載順鉑處理上述兩種細胞，結果顯示M2巨噬細胞來源的外泌體使順鉑對鉑敏感A2780細胞和鉑耐藥A2780/DDP細胞的細胞毒性作用分別提高1.4倍和1.7倍，可以看出，無論OC耐藥性如何，負載順鉑的臍帶血M1來源的外泌體能有效提高順鉑的細胞毒性，這種作用可能是由外泌體在腫瘤細胞中的優(yōu)先累積和M1巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷作用介導的。

通過簇狀規(guī)則間隔短回文重復序列(CRISPR)相關的核酸內切酶(Cas)9進行基因編輯是抗腫瘤研究中的重要工具 ，有必要開發(fā)一種能有效的將其運送至細胞的載體。Kim等[36]研究表明與上皮細胞來源的外泌體相比，腫瘤來源的外泌體能選擇性地在SKOV3異種移植小鼠的卵巢腫瘤中積聚，攜帶CRISPR/Cas的腫瘤來源的外泌體能抑制聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)的表達，從而誘導OC細胞的凋亡。此外CRISPR/Cas介導的基因編輯對PARP-1的抑制增強了OC細胞對順鉑的敏感性。雖然多種植物提取物在各種癌癥中有抗腫瘤作用，但由于缺乏有效的運輸載體而限制了其臨床應用。有研究表明外泌體作為運輸漿果花色苷的載體，可以提高該藥在治療OC方面的生物利用度，有效抑制OC的生長[45]?？偟膩碚f，外泌體作為運輸治療藥物的載體能明顯提高藥物對OC的治療效果，為OC患者的治療帶來了新的希望。

3.2.3 利用外泌體對癌細胞的歸巢效應促進OC治療:卵巢癌分泌的外泌體通過免疫抑制、血管生成、基質細胞重塑和癌基因重新編程誘導轉移前生態(tài)位的形成。轉移前生態(tài)位是腫瘤在廣泛轉移前分泌的外泌體所形成的微環(huán)境[46]。利用外泌體對原代癌細胞的歸巢作用可以作為OC治療的靶點。De la Fuente等[47]研究表明將OC腹水來源的外泌體嵌入到工程生物材料中并植入到小鼠腹腔，能產(chǎn)生模擬的人工轉移前生態(tài)位。該模擬轉移前生態(tài)位能有效的從腹水中招募游離OC細胞，從而阻止OC細胞向正常的盆腔臟器轉移，顯著提高生存率?？梢钥吹剑@種靶向技術將會是未來腫瘤治療研究的新領域。

OC嚴重威脅女性健康，早期診斷困難、轉移率高和化療耐藥是導致患者預后差的主要原因。外泌體作為腫瘤微環(huán)境中信號轉導的載體，在OC的發(fā)生發(fā)展、耐藥及免疫抑制中起著重要作用。外泌體通過轉移耐藥相關miRNA、藥物輸出轉運蛋白及誘導EMT促進OC的化療耐藥。了解不同細胞來源的外泌體在OC耐藥及其發(fā)展過程中發(fā)揮作用的分子學機制，有助于我們在OC治療中開發(fā)針對外泌體的靶向治療的新方法，比如抑制OC來源的外泌體釋放、利用外泌體攜帶的TAA增強機體的免疫反應、利用外泌體的歸巢效應和外泌體天然納米顆粒的特性作為藥物運輸?shù)妮d體。