甘建雄 李智 趙煜輝 李鵬 李雪蓮

直腸癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，其死亡率位居惡性腫瘤第三位，僅次于肝癌和肺癌[1]。由于發(fā)病具有隱匿性，當(dāng)患者出現(xiàn)便血、排便習(xí)慣改變等癥狀時(shí)往往處于中晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，侵襲和轉(zhuǎn)移更是導(dǎo)致直腸癌患者死亡的主要原因。因此，尋找新的生物標(biāo)記物，開發(fā)有效的治療策略對(duì)延長直腸癌患者生存時(shí)間意義重大。據(jù)報(bào)道，多種微小RNA(microRNA，miRNA)通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移或藥物敏感性參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展。例如，miR-31[2]、miR-3174[3]在結(jié)腸癌腫瘤樣本中表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)為致癌基因，而miR-144等[4]miRNA表達(dá)下調(diào)，表現(xiàn)為抑癌基因。miR-3127-5p是近年來發(fā)現(xiàn)的miRNA，既往研究表明miR-3127-5p在膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌腫瘤樣本中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-3127-5p可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5,6]。然而miR-3127-5p在直腸癌中的確切生物學(xué)作用筆者所見尚未有研究。本研究通過檢測直腸癌組織樣本中miR-3127-5p的表達(dá)水平，探究miR-3127-5p在腫瘤發(fā)生中的作用，以期為直腸癌臨床診療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1463購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Hyclone公司；TRIzol試劑、放射免疫沉淀緩沖液購于北京索萊寶公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購于大連TaKaRa公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell count kit 8，CCK-8)購于日本同仁生化研究所；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國Corning公司；兔源三結(jié)構(gòu)域蛋白家族28(tripartite motif 28，TRIM28)、p21、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體以及山羊抗兔IgG購于美國Abcam公司；miR-3127-5p模擬物(miR-3127-5p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、TRIM28小干擾RNA(si-TRIM28)及其陰性對(duì)照(si-NC)、空載質(zhì)粒(pcDNA)、TRIM28過表達(dá)載體(pcDNA-TRIM28)的構(gòu)建和測序由有南京金斯瑞公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將直腸癌細(xì)胞SW1463培養(yǎng)在含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于含95%空氣、5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。按照1∶3比例傳代，每周2次。

1.3 RT-qPCR檢測miR-3127-5p和TRIM28 mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑提取直腸癌組織、癌旁組織樣本中總RNA，并進(jìn)行濃度和純度測定。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNAs，利用SYBR Green Master Mix在ABI 7500中上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。TRIM28上游引物5’-AGCGGGTGAAGTACACCAAG-3’，下游引物5’-ACCCAAAGCCATAGCCTTCC-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，下游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將SW1463細(xì)胞(2×105cells/孔)接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度約為50%時(shí)，利用 Lipofectamine 3000將miR-NC、miR-3127-5p mimics、si-NC、si-TRIM28、miR-3127-5p+pcDNA、miR-3127-5p+pcDNA-TRIM28分別轉(zhuǎn)染SW1463細(xì)胞，依次記為miR-NC組、miR-3127-5p組、si-NC組、si-TRIM28組、miR-3127-5p+pcDNA組、miR-3127-5p+pcDNA-TRIM28組，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)檢測轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活力 細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組踐行干預(yù)后，胰酶消化后制成密度為3×104cells/ml的單細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液加入到96孔板中，培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，孵育2 h后，采用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度值，吸光度值即為細(xì)胞增殖活力。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 將按1∶8 稀釋的Matrigel溶液均勻包被于Transwell小室上室膜，室溫風(fēng)干后備用。將Transwell小室置于24孔板中，用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸各組SW1463細(xì)胞，取200 μl細(xì)胞懸液接種于上室腔；取500 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基接種于下室腔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕拭去上室膜細(xì)胞，采用4%多聚甲醛固定下室膜15 min，然后用5%的結(jié)晶紫溶液固定下室膜15 min。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，記錄細(xì)胞總數(shù)，取均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)采用未包被基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.7 Western blot檢測TRIM28、p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 用放射免疫沉淀緩沖液消化各組SW1463細(xì)胞，獲得細(xì)胞蛋白。將蛋白樣品置于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；結(jié)束后，采用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h；稀釋的一抗溶液4℃孵育膜過夜；PBS洗滌后，與稀釋的二抗結(jié)合2 h。顯影后，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含有miR-3127-5p結(jié)合位點(diǎn)序列的野生型(WT-TRIM28)或突變序列的突變型(MUT-TRIM28)熒光素酶報(bào)告基因載體由南京金斯瑞生物公司完成。利用Lipofectamine 3000將miR-3127-5p mimics、miR-NC分別與WT或MUT熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染SW1463細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h，雙熒光素酶報(bào)告基因測定系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-3127-5p和TRIM28在直腸癌組織中的表達(dá) 相較于癌旁組織，直腸癌組織中miR-3127-5p的表達(dá)量明顯降低，TRIM28 mRNA和TRIM28蛋白的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 TRIM28蛋白表達(dá)

表1 miR-3127-5p和TRIM28在直腸癌組織中的表達(dá)

2.2 miR-3127-5p過表達(dá)對(duì)直腸癌SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于轉(zhuǎn)染miR-NC，轉(zhuǎn)染miR-3127-5p mimics后SW1463細(xì)胞miR-3127-5p的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 miR-3127-5p過表達(dá)對(duì)直腸癌SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

2.3 miR-3127-5p靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá) StarBase網(wǎng)站在線預(yù)測顯示miR-3127-5p與TRIM28的3’UTR之間存在互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-NC和WT-TRIM28，miR-3127-5p mimics和WT-TRIM28共轉(zhuǎn)染后SW1463細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；相較于共轉(zhuǎn)染miR-NC和MUT-TRIM28，miR-3127-5p mimics和MUT-TRIM28共轉(zhuǎn)染后SW1463細(xì)胞熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示，相較于轉(zhuǎn)染miR-NC，轉(zhuǎn)染miR-3127-5p mimics后SW1463細(xì)胞TRIM28蛋白表達(dá)量顯著降低；相較于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC，轉(zhuǎn)染anti-miR-3127-5p后SW1463細(xì)胞TRIM28蛋白表達(dá)量顯著升高同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、4，圖3、4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 miR-3127-5p調(diào)控TRIM28蛋白的表達(dá)

圖3 TRIM28的3’UTR中含有與miR-3127-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖4 TRIM28蛋白表達(dá)

2.4 干擾TRIM28表達(dá)對(duì)直腸癌SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于轉(zhuǎn)染si-NC，轉(zhuǎn)染si-TRIM28后SW1463細(xì)胞TRIM28蛋白表達(dá)顯著顯著降低，細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 干擾TRIM28表達(dá)對(duì)直腸癌SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

圖5 TRIM28和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 TRIM28過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3127-5p過表達(dá)對(duì)直腸癌SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用 相較于轉(zhuǎn)染miR-NC，轉(zhuǎn)染miR-3127-5p mimics后SW1463細(xì)胞TRIM28蛋白的表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高；相較于共轉(zhuǎn)染miR-3127-5p和pcDNA，共轉(zhuǎn)染miR-3127-5p和pcDNA-TRIM28后SW1463細(xì)胞TRIM28蛋白的表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高，p21蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6，圖6。

圖6 TRIM28和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 TRIM28過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-3127-5p過表達(dá)對(duì)直腸癌SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討論

目前，全球直腸癌病情依然嚴(yán)峻。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年超過100萬人診斷為直腸癌，約70多萬人死于該疾病，且其年發(fā)病率呈升高趨勢，已對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。因此，探索直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有助于對(duì)開發(fā)新的診療策略，對(duì)改善直腸癌臨床診療現(xiàn)狀具有重要意義。

近年來，miRNA和惡性腫瘤的相關(guān)研究對(duì)腫瘤治療提供了新的思路[7]。Yang等[8]證實(shí)非小細(xì)胞肺癌中miR-3127-5p呈低表達(dá)，且轉(zhuǎn)移性肺癌組織中miR-3127-5p的表達(dá)較原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌組織更低，miR-3127-5p低表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲。miR-3127-5p在肝癌中也呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-3127-5p通過誘導(dǎo)S期阻滯，從而抑制肝癌細(xì)胞生長[9]。本研究通過RT-qPCR檢測miR-3127-5p在直腸癌組織和癌旁組織樣本中表達(dá)差異，結(jié)果顯示直腸癌組織中miR-3127-5p表達(dá)較癌旁組織樣本顯著降低，推測miR-3127-5p在直腸癌中可能發(fā)揮抑制基因作用。通過外源性轉(zhuǎn)染miR-3127-5p mimics上調(diào)miR-3127-5p表達(dá)，直腸癌細(xì)胞株SW1463的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，促增殖蛋白CyclinD1、促轉(zhuǎn)移蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)量顯著降低，抗增殖蛋白p21表達(dá)量顯著升高。進(jìn)一步證實(shí)miR-3127-5p在直腸癌中具有抑癌基因作用。

過表達(dá)miR-3127-5p可抑制SW1463細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力，但其具體作用機(jī)制并不明確。本研究通過StarBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)miR-3127-5p與TRIM28的3’UTR之間存在互補(bǔ)堿基序列。TRIM28作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)域蛋白，是DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其還可通過抑制p53活性促進(jìn)腫瘤發(fā)生[10]。研究表明，TRIM28在大腸癌[11,12]、膠質(zhì)瘤[13,14]、非小細(xì)胞肺癌[15]、卵巢癌[16]等惡性腫瘤中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。此外，miR-140-3p通過靶向下調(diào)TRIM28表達(dá)還可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[17]。

本研究顯示，直腸癌中TRIM28亦呈高表達(dá)，提示干擾TRIM28表達(dá)可能是抑制直腸癌進(jìn)展的重要機(jī)制。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和western blot檢測證實(shí)TRIM28是miR-3127-5p的下游靶基因，且miR-3127-5p負(fù)調(diào)控TRIM28表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染si-TRIM28干擾miR-3127-5p表達(dá)，SW1463細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達(dá)量顯著降低，p21表達(dá)量顯著升高。進(jìn)一步研究表明過表達(dá)TRIM28還可逆轉(zhuǎn)miR-3127-5p對(duì)SW1463細(xì)胞增殖、遷移侵襲的抑制作用。提示在直腸癌細(xì)胞中miR-3127-5p通過靶向下調(diào)TRIM28表達(dá)參與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程。

綜上所述，miR-3127-5p在直腸癌中呈低表達(dá)，TRIM28呈高表達(dá)。過表達(dá)miR-3127-5p通過靶向抑制TRIM28表達(dá)可降低直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和能力。因此，miR-3127-5p有望成為直腸癌臨床診療的新靶點(diǎn)。