趙 鵬，李 東，周一民，劉曉風(fēng)，廖銀章

（1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，成都 610041）

一株脫硫菌株的分離鑒定及其對(duì)硫化物的去除效果驗(yàn)證*

趙 鵬1,2，李 東1?，周一民3，劉曉風(fēng)1?，廖銀章1

（1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，成都 610041）

為獲得適合生物脫硫工程應(yīng)用的硫氧化細(xì)菌，取污水處理廠曝氣池活性污泥，采用人工模擬硫化物廢水作為硫源富集培養(yǎng)并經(jīng)分離純化，得到一株能夠高效快速去除廢水中硫化物的硫氧化細(xì)菌菌株DS-7。該菌為短桿狀、長(zhǎng)0.8～2 μm、寬0.6～0.8 μm、革蘭氏陰性，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.0。通過(guò)對(duì)該菌的16SrDNA序列測(cè)定，并結(jié)合其形態(tài)和生理特性鑒定，該菌株屬于鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）。Sphingobacterium sp.DS-7去除硫化物性能研究結(jié)果

硫氧化細(xì)菌；生物脫硫；硫化物；16SrDNA；鑒定

0 引 言

天然氣或沼氣等燃?xì)庵泻懈邼舛鹊牧蚧瘹洌蚧瘹涞拇嬖诓粌H會(huì)對(duì)人體健康和環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅，還會(huì)腐蝕金屬管道等設(shè)備[1-2]。因此，這些燃?xì)庵辛蚧瘹涞拿摮絹?lái)越受到人們的重視。目前最常用的脫硫方法包括物理法、化學(xué)法以及生物法[3]。其中生物脫硫（biological desulfurization）是自20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)[4]。生物脫硫具有不需要催化劑、效率高、低成本、硫轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，擁有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景，可應(yīng)用于石油脫硫、天然氣脫硫、沼氣脫硫、煙道氣脫硫、污水處理廠廢水脫硫和制革廢水脫硫等領(lǐng)域，生物脫硫技術(shù)也成為了目前脫硫行業(yè)中的研究熱點(diǎn)以及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[5]。

生物脫硫的核心在于硫氧化細(xì)菌。對(duì)于工程應(yīng)用，需要選擇能夠耐受較高硫化物濃度、硫化物去除率較高、硫化物氧化速率較快的細(xì)菌。本研究取污水處理廠曝氣池活性污泥進(jìn)行富集馴化，并從馴化培養(yǎng)物中分離得到一株能夠高效快速地去除硫化物的硫氧化細(xì)菌，對(duì)該菌的形態(tài)、生理特性進(jìn)行研究，并測(cè)定其16SrDNA序列；同時(shí)對(duì)該菌去除硫化物的能力進(jìn)行了研究，為該菌株的生物脫硫工程應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品取自成都市第二污水處理廠曝氣池活性污泥。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基成分[6-8]：Na2S·9H2O，5.0 g/L；NaHCO3，1.0 g/L；KH2PO4，1.0 g/L；K2HPO4，1.0 g/L；MgCl2·6H2O，0.4 g/L；NH4Cl，0.4 g/L；微量元素溶液1 mL；維生素溶液1 mL；最后，pH值調(diào)至7.0。

分離純化培養(yǎng)基成分[9-11]：Na2S2O3·5H2O，10 g/L；NaHCO3，1.0 g/L；KH2PO4，1.0 g/L；K2HPO4，1.0 g/L；MgCl2·6H2O，0.8 g/L；NH4Cl，0.4 g/L；微量元素溶液1 mL；維生素溶液1 mL；最后，pH值調(diào)至7.0。

1.3 脫硫菌的富集培養(yǎng)和篩選

1.3.1 脫硫菌的富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)裝置如圖1。

圖1 富集馴化反應(yīng)器Fig.1 The reactor of enrichment and acclimatization

配置5 L含有硫化物的富集培養(yǎng)基，加入裝有軟性填料的反應(yīng)器中，然后按照總體積20%的接種量接種活性污泥。每天定時(shí)添加置換500 mL富集培養(yǎng)基，曝氣速率為0.1 L/min，培養(yǎng)環(huán)境溫度為28℃～30℃，如此連續(xù)7 d，當(dāng)填料上出現(xiàn)一層淡黃色的絮狀生物膜時(shí)，即可取富集液進(jìn)行分離。

1.3.2 脫硫菌的分離純化

將富集液進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e取各稀釋液（10-2～10-7稀釋度）0.1 mL于各瓊脂平板上進(jìn)行涂布[12]。將涂布后的平板于30℃培養(yǎng)3～4 d直至培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)明顯的菌落。選取合適稀釋度的培養(yǎng)皿，用接種環(huán)在無(wú)菌環(huán)境中挑取形態(tài)和顏色不一的單菌落接入下一批已滅菌的培養(yǎng)皿中，待菌落長(zhǎng)出后，重復(fù)之前的步驟3～4次，不斷分離純化，得到純的菌株。挑取菌落在斜面上保藏。

本實(shí)驗(yàn)一共篩選得3株菌株，包括鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp.）DS-7、假單胞菌（Pseudomonas）DS-8、脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）DS-4，通過(guò)對(duì)這三株菌株的生理和分子鑒定，我們選取目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道的鞘氨醇桿菌進(jìn)行研究。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)和生理特性

在振蕩速度200 r/min的條件下培養(yǎng)25 h，確定最適生長(zhǎng)溫度和最適生長(zhǎng)pH，每組設(shè)三個(gè)平行，采用分光光度法測(cè)定菌液的OD600值。在初始pH=7.0條件下確定最適生長(zhǎng)溫度，培養(yǎng)溫度為20℃～40℃；在溫度30℃條件下確定最適生長(zhǎng)pH，初始pH值為5.0 ～9.0[13]。

采用自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀（芬蘭Bioscreen）測(cè)定該菌株的生長(zhǎng)曲線，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30℃，波長(zhǎng)λ=600 nm。培養(yǎng)基為通用細(xì)菌培養(yǎng)基，成分為：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，pH值調(diào)至7.0～7.2。

1.4.2 菌株16SrDNA序列分析

將生長(zhǎng)有菌株DS-7的培養(yǎng)物送至生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16SrDNA鑒定，其使用的引物為細(xì)菌通用的引物27F（正向）（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（反向）（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。最后將測(cè)定的16SrDNA序列用BLAST中已知的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較[9,11,14-16]。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建采用軟件MEGA6.0。

1.5 脫硫特性研究

1.5.1 硫化物濃度對(duì)脫硫效果的影響

分別配制實(shí)測(cè)硫（S2-）濃度為78、176、359、460、700、896、1 121 mg/L的人工模擬硫化物廢水150 mL，接種菌液50 mL，溫度30℃、振蕩速度200 r/min的條件下培養(yǎng)，不加菌的作為空白對(duì)照，每隔2 h測(cè)定硫化物的濃度以及單質(zhì)硫的濃度。

1.5.2 脫硫效果驗(yàn)證

將菌液在無(wú)菌環(huán)境中倒入裝有200 mL硫（S2-）濃度為650 mg/L（實(shí)測(cè)）人工模擬硫化物廢水的500 mL三角瓶中，溫度30℃、振蕩速度200 r/min的培養(yǎng)條件下，每隔30 min取樣一次，測(cè)定硫化物濃度、單質(zhì)硫濃度。

1.5.3 硫顆粒形態(tài)

對(duì)脫硫后的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，將沉淀物預(yù)處理后在掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察其形態(tài)[17]。

1.6 測(cè)定方法

硫化物的測(cè)定方法采用亞甲基藍(lán)分光光度法（λ=660 nm）[18]；菌液濃度的測(cè)定方法為OD值法（λ=600 nm）；單質(zhì)硫濃度采用四氯化碳萃取-高效液相色譜（HPLC）法（λ=240 nm）對(duì)離心后的萃取液進(jìn)行檢測(cè)[19]；pH值采用便攜式pH計(jì)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)及生理特性

2.1.1 菌株的形態(tài)特征

富集培養(yǎng)液經(jīng)多次分離篩選得到一株具有脫硫能力的菌株DS-7。在平板培養(yǎng)基上該菌落呈圓形，濕潤(rùn)，凸出，邊緣整齊，顏色為淡黃色。在掃描電子顯微鏡下觀察，該菌均為短桿狀（如圖2）、長(zhǎng)0.8～2 μm、寬0.6～0.8 μm、革蘭氏染色陰性。

圖2 菌株DS-7在掃描電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)Fig.2 Morphology of the strain DS-7 under SEM

2.1.2 菌株的最適生長(zhǎng)溫度

如圖3所示，菌株在20℃～40℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在30℃環(huán)境下生長(zhǎng)效果最好。

圖3 溫度對(duì)菌株DS-7生長(zhǎng)的影響Fig.3 The influence of temperature on the growth of strain DS-7

2.1.3 最適生長(zhǎng)pH

從圖4可以看出，該菌在6.0～8.0的pH環(huán)境中可以生長(zhǎng)，最適pH值為7.0；在pH ≤ 5.0和pH ≥ 9.0時(shí)，該菌基本上不生長(zhǎng)。其生長(zhǎng)符合大多數(shù)脫硫細(xì)菌在pH值為6.0～8.0范圍生長(zhǎng)的特點(diǎn)[6]，其最適pH為中性值，在環(huán)境中較易調(diào)節(jié)。

圖4 pH值對(duì)菌株DS-7生長(zhǎng)的影響Fig.4 The influence of pH on the growth of strain DS-7

圖5 菌株DS-7在好氧條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of the strain DS-7 under aerobic condition

2.1.4 菌株的生長(zhǎng)曲線

由圖5可知，菌株DS-7的延滯期約為3 h，然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)25 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)17 h，生長(zhǎng)約42 h之后進(jìn)入衰亡期。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序所得菌株DS-7的16SrDNA序列長(zhǎng)度為1391 bp，在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST比對(duì)分析結(jié)果顯示，菌株DS-7與鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp.，Accession number為KU668559.1）的同源性達(dá)99%。使用MEGA 6.0構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖6所示。

從圖6中的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，在所獲得的16條有效序列中，有8條與已知菌株DS-7的16SrRNA序列相似度較高，為95%～98%；8條與Sphingobacterium sp.的16SrRNA序列相似度為94%。因此，鑒定該菌株屬于鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp.）。

圖6 菌株DS-7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of DS-7 strain

2.3 菌株的脫硫性能

菌株DS-7在不同濃度的硫化物中培養(yǎng)4 h后硫化物去除率和硫化物轉(zhuǎn)化成單質(zhì)硫的轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表1。

表1 菌株DS-7處理各濃度廢水4 h的結(jié)果Table 1 The consequence of strain DS-7 disposing wastewater of various concentrations for 4 h

由表1可知，硫化物的去除率隨著硫化物濃度的增加而降低。當(dāng)濃度小于700 mg/L時(shí)，去除率可達(dá)到87.15%以上；當(dāng)硫化物濃度大于700 mg/L時(shí)，去除率迅速下降。此外在460 mg/L和700 mg/L兩個(gè)濃度之間，硫化物轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硫的轉(zhuǎn)化率較高，分別為37.19%和44.12%。

2.4 菌株的脫硫效果驗(yàn)證

將菌株接種至硫（S2-）濃度為650 mg/L的人工模擬廢水中，該菌株在30℃、震蕩速度為200 r/min條件下的脫硫效果如圖7所示。菌株DS-7培養(yǎng)4 h后硫化物的去除效率達(dá)到95%以上，單質(zhì)硫的累計(jì)最高濃度達(dá)到293.013 mg/L，相應(yīng)的硫轉(zhuǎn)化率實(shí)際達(dá)到了45.08%。這說(shuō)明該菌株對(duì)硫化物具有良好的脫除效果。閆旭等[20]分離得到一株具有氧化能力的那不勒斯硫桿菌（Thiobacillus neapolitanus），在硫化物為唯一硫源，質(zhì)量濃度分別為60 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L時(shí)，4 h硫化物去除率分別為89.72%、71.25%、63.45%和13.31%。王庭等[21]的研究結(jié)果表明，溶氧和氧化還原電位對(duì)硫轉(zhuǎn)化率有較大影響，今后將通過(guò)工藝優(yōu)化，進(jìn)一步提高該菌的單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率。

圖7 菌株DS-7在人工模擬廢水中的脫硫表現(xiàn)Fig.7 The performance of the desulfurization of strain DS-7 in the artificial wastewater

鞘氨醇桿菌脫硫性能為首次發(fā)現(xiàn)，為生物脫硫拓展了菌種庫(kù)。與目前文獻(xiàn)報(bào)道的生物脫硫菌株相比，菌株DS-7具有快速高效去除高負(fù)荷硫化物廢水中S2-的優(yōu)勢(shì)；且該菌營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型為兼性營(yíng)養(yǎng)型，在有機(jī)碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h即可進(jìn)入對(duì)數(shù)期。因此，可以通過(guò)有機(jī)碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)來(lái)獲得高密度的菌體用于生物脫硫工程的快速啟動(dòng)。

2.5 單質(zhì)硫的形態(tài)

圖8 生物硫顆粒在掃描電鏡下的形態(tài)Fig.8 The morphology of biological sulfur particles under the SEM

本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株DS-7處理后的模擬廢水中的硫顆粒進(jìn)行了預(yù)處理，在掃描電鏡下進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出處理后的廢水中硫顆粒形態(tài)大致呈不規(guī)則的八面體，粒徑遠(yuǎn)大于菌體。BOSCH等[17]也對(duì)生物脫硫反應(yīng)器中生物硫顆粒做了電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其生物硫顆粒大多呈形狀一致的不規(guī)則多面體。

3 結(jié) 論

（1）從污水處理廠曝氣池活性污泥中分離獲得一株能夠高效快速地去除廢水中硫化物的硫氧化細(xì)菌菌株DS-7。根據(jù)形態(tài)和生理特性、16SrDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定，初步確定菌株DS-7為鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp.）。菌株DS-7的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH值為7.0。

（2）當(dāng)硫（S2-）濃度為650 mg/L時(shí)，培養(yǎng)4 h后S2-的去除率達(dá)到95%以上；單質(zhì)硫的累積濃度達(dá)到293.013 mg/L，相應(yīng)的單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率為45.08%。

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Isolation and Identification of a Desulfurization Strain and Its Sulfide Removal Performance

ZHAO Peng1,2,LI Dong1,ZHOU Yi-min3,LIU Xiao-feng1,LIAO Yin-zhang1
(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Chengdu Organic Chemicals Co.,Ltd.,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China)

In order to obtain sulfur-oxidizing bacteria for engineering application of biodesulfurization,the enrichment and acclimation of aerobic activated sludge was carried out by using artificial sulfide wastewater as a sulfur source.A sulfur-oxidizing bacteria strain DS-7 with strong ability of sulfide removal was isolated from the enrichment culture.The strain DS-7 was Gram-negative and short rod shaped with length of 0.8～2 μm and width of 0.6～0.8 μm.The optimal growth temperature and pH was 30oC and 7.0,respectively.The identified strain DS-7 belongs to the genus of Sphingobacterium according to the 16SrDNA bacterial sequences and the morphological and physiological characterization.The sulfide removal performance tests of Sphingobacterium sp.DS-7 showed that the sulfide removal rate was more than 95% and the sulfur conversion rate reached 45.08% after culturing for 4 h at the initial sulfide concentration of 650 mg/L.The sulfur formed by Sphingobacterium sp.DS-7 was in the shape of irregular octahedron.

sulfur-oxidizing bacteria;biodesulfurization;sulfide;16SrDNA;identification

TK6

A

10.3969/j.issn.2095-560X.2016.06.001

2095-560X（2016）06-0425-06

趙 鵬（1992-），男，碩士研究生，主要從事生物脫硫研究。

李 東（1982-），男，博士，副研究員，主要從事生物燃?xì)飧咝е苽渑c高值利用研究。

劉曉風(fēng)（1964-），男，研究員，主要從事固體廢棄物處置和生物質(zhì)能源研究。

2016-09-14

2016-10-21

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD21B01）

? 通信作者：李 東，E-mail：lidong@cib.ac.cn；劉曉風(fēng)，E-mail：liuxf@cib.ac.cn

表明：當(dāng)硫化物濃度為650 mg/L時(shí)，該菌的4 h硫化物去除率達(dá)到95%以上，相應(yīng)的硫轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到45.08%，生成的單質(zhì)硫顆粒形狀為不規(guī)則八面體。