吳丹丹，白云龍，李雪純，周金玲，周玉龍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

犢牛群發(fā)性肺炎鑒別診斷與藥敏實驗

吳丹丹，白云龍，李雪純，周金玲，周玉龍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

2015年3月，黑龍江省林甸花園鄉(xiāng)某牛場，犢牛爆發(fā)咳嗽，死之前頭往后仰抽搐，口腔里有唾液。通過對病死犢牛剖檢結(jié)果可見，病灶主要集中在肺部，無菌采取病料進行細菌的分離鑒定，將所分離的細菌通過臨床檢查、生物學(xué)特性鑒定和PCR鑒定分析，確診是由巴氏桿菌及化膿隱秘桿菌混合感染引起的肺炎從而導(dǎo)致死亡。動物實驗也顯示純培養(yǎng)物對小鼠致死率較高，藥敏試驗表明這兩種菌對鏈霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢呋肟等藥物高度敏感。

巴氏桿菌；化膿隱秘桿菌；診斷

2015年3月黑龍江省林甸某牛場，3～4個月左右的牛犢開始出現(xiàn)異常，在早上突然出現(xiàn)抽搐，口腔里有唾液，之后死亡。從流行病學(xué)、臨床癥狀、抹片染色鏡檢、實驗室檢察等多方面手段得出結(jié)論，及化膿隱秘桿菌和巴氏桿菌混合感染導(dǎo)致肺炎，最后致死。

化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）是一種不運動，不形成芽孢的革蘭氏陽性短桿菌。該菌是隱秘桿菌屬中毒力最強的病原體，是經(jīng)濟型家畜（牛、羊和豬）的一種條件性致病菌，也是這些動物黏膜上的一種共生體，是引起牛發(fā)病和死亡的主要原因[1]。近年來化膿隱秘桿菌引起的犢牛肺炎發(fā)病率逐年升高，常出現(xiàn)爆發(fā)的情況[2]。目前已發(fā)現(xiàn)的化膿隱秘桿菌毒力因子有4類，分別為化膿隱秘桿菌溶血素（Pyolysin，PLO）、膠原結(jié)合蛋白（CbpA）、神經(jīng)氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白（Fim）。PLO是A．pyogenes主要的毒力因子，屬于膽固醇依賴性溶細胞素（CDC）家族，具有溶解各種動物血細胞的能力，包括多形核細胞和巨噬細胞[3-4]?；撾[秘桿菌最早從牛的膿汁中分離到，主要寄生在動物的上呼吸道、消化道和泌尿生殖道等黏膜處，是一種條件性致病菌，可引起奶牛的乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和子宮炎，引起肉牛和高產(chǎn)奶牛的肝膿腫、豬的肺炎等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失[5]。

牛巴氏桿菌病又稱牛出血性敗血癥，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性熱性傳染病，是一種內(nèi)源性致病菌，且對培養(yǎng)條件要求非常高。以高熱、肺炎、急性腸炎以及內(nèi)臟器官廣泛性出血為主要特征。該菌抵抗力弱，在干燥空氣中僅存活2～3 d，在血液、排泄物或分泌物中可生存6～10 d，但在腐敗尸體中可存活1～6月；陽光直射下數(shù)分鐘死亡，高溫立即死亡。尤以帶溶血的巴氏桿菌殺傷性最強，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與培養(yǎng)基Maker DL2000、premix Taq均購于TaKaRa公司，酒精、二甲苯、生理鹽水、甘油、革蘭氏染色液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、生化試驗管（購于杭州濱和微生物試劑有限公司）、藥敏片（購于上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司）。

1.1.2 病料無菌采取病死犢牛的各部分病變組織，取病變交叉部位。標(biāo)記放在無菌培養(yǎng)皿中-20℃冰柜中凍存。

1.1.3 實驗動物實驗動物為昆明系小鼠，體重為18 g左右。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷對牛養(yǎng)殖的基本情況進行調(diào)查與分析，主要從牛舍的飼養(yǎng)管理情況（主要包括喂養(yǎng)的飼料、水、通風(fēng)、光照、運動情況）、牛進行的保健工作（剛出生階段、妊娠階段使用的保健藥品）、使用疫苗情況（疫苗廠家、使用疫苗的時間段）、養(yǎng)殖母牛規(guī)模，以及患病牛的大小，以及死亡率回復(fù)率的統(tǒng)計數(shù)字，再配合牛群是否有既往病史等方面著手。

觀察病牛犢的臨床癥狀，首先從外觀，主要從膚色被毛、眼結(jié)膜、眼球顏色、鼻腔口腔、腹圍寬度著手。再繼續(xù)用手摸四肢的關(guān)節(jié)以及骨質(zhì)的硬度著手。

對病死牛犢進行剖檢，首先觀察淋巴結(jié)和喉頭是否腫脹、出血、充血。無菌打開腹腔，觀察是否有積液，以及腸段、腸黏膜、大網(wǎng)膜等是否有寄生蟲，觀察腎臟、脾臟、胃、肝臟、膽囊表面是否出現(xiàn)腫大出血，有沒有纖維素性滲出。開啟胸腔觀察是否有積液，以及肺臟、心臟、膈肌、胸膜是否出現(xiàn)粘連。將膀胱黏膜、胃黏膜等用水清洗后，觀察是否有潰瘍、出血等癥狀。將腎臟等出現(xiàn)病變的器官割開觀察是否有結(jié)節(jié)、出血等狀況。觀察完之后，無菌采取病健結(jié)合部位于滅菌平皿中，準備下一步檢測。

1.2.2 細菌分離取各個臟器病料涂片，利用革蘭氏染色方法進行染色。根據(jù)顯微鏡觀察結(jié)果，根據(jù)鏡下細菌形態(tài)將細菌接種于不同的培養(yǎng)基，從而為鑒別細菌做鋪墊。當(dāng)接種在培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌落的形態(tài)及生長狀況，主要從濕潤程度、大小、形態(tài)、硬度、突起程度、邊緣、是否溶血方面進行觀察用接種環(huán)挑取可疑菌落進行染色，觀察其與預(yù)期菌株是否相似。如果相似用接種環(huán)挑取單菌落，置于新的血液瓊脂培養(yǎng)基上進行純化。

1.2.3 細菌鑒定

1.2.3.1 生化鑒定根據(jù)細菌分離的結(jié)果，用滅菌接種環(huán)勾取單菌落純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、靛基質(zhì)、硫化氫、衛(wèi)矛醇等各種生化培養(yǎng)基中（與懷疑的菌落的生化反應(yīng)相對應(yīng)），37℃恒溫培養(yǎng)24～36 h后觀察并記錄結(jié)果[2]（培養(yǎng)時主要根據(jù)該菌對氧的需求進行培養(yǎng)）。

1.2.3.2 PCR鑒定根據(jù)GenBank中登錄的豬源A．pyogenes PLO序列（AB027461），應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計引物，擴增牛源PLO基因。上游引物P1 5'-GGTTGAGTTAAGGAAGGCGGAAG 298-320bp；下游引物P2 5'-TCGTTGCGGTAACTCACTAGGA-3’1924～1945bp引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。同時引入巴氏桿菌的特異性kmt基因的引物。

細菌基因組提取DNA及PCR擴增，參照文獻[6]進行細菌基因組DNA制備，-20℃保存?zhèn)溆?，即可作為PCR反應(yīng)的模板，設(shè)計一個25 μL的反應(yīng)體系，P1和P2各1 μL，Mix（Taq酶、dNTP、buffer、去離子水）12.5 μL，去離子水8.5 μL，DNA模板2 μL；PCR擴增條件為：95℃2 min，94℃90 s，53.5℃1 min，72℃2 min擴增30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物加于1.0%瓊脂糖凝膠中，用凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，根據(jù)電泳圖片分析片段大?。ㄒ訫aker DL2000 bp為標(biāo)準參照），觀察結(jié)果是否在標(biāo)準區(qū)間內(nèi)。

1.2.4 動物實驗將菌種放入液體培養(yǎng)基中根據(jù)所需時間、溫度、氧分培養(yǎng)，各取1 mL菌液，離心之后選取上層清液，抽取0.2 mL上清液、0.2 mL菌液十倍稀釋液、0.2 mL注入純菌液給編號為1、2、3的小鼠進行尾靜脈，對每只做好標(biāo)記，同時設(shè)立一只對照（注入生理鹽水即可）。記錄注射后小鼠的精神狀態(tài)、毛色、死亡數(shù)量及死亡時間。

1.2.5 藥敏試驗用滅菌生理鹽水100 μL將純化好的病原微生物在原培養(yǎng)基上刮下混勻，用移液槍吸取50～100 μL至待做藥敏試驗的新血平板上，用滅菌L棒蘸取菌液均勻涂抹到整個血液瓊脂培養(yǎng)基上，均勻分配貼上各種藥敏片，每個培養(yǎng)基上平均貼7片，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h（根據(jù)菌種所需的培養(yǎng)條件差異可做更改）后判定結(jié)果。判定參照美國實驗室標(biāo)準委員會（NCCLS）藥敏紙片擴散法法規(guī)。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果

黑龍江省林甸鄉(xiāng)某牛場飼養(yǎng)的200多頭牛，飼養(yǎng)管理及保健都做得很好，于3月牛犢出現(xiàn)抽搐，口腔唾液增多后死亡，牛犢曾患過群發(fā)性咳嗽，治愈率可達90%～95%。最初沒有有特征性的臨床癥狀（在死前一天也沒有什么癥狀），在死亡之前會有頭頸后仰，四肢抽搐，嘴里唾液增多的現(xiàn)象。

對該牛進行剖檢打開腹腔即發(fā)現(xiàn)腹腔積液淋巴結(jié)腫大。肺部有淤血心葉尖葉膈葉有小葉性肺炎（支氣管肺炎），表面水腫、肝樣變末端發(fā)展成大葉性肺炎，肺表面有疑似膿包。肝腫大，膽囊腫大。腎臟出血嚴重，腸系膜充血、出血、潰瘍。心肌有出血。肺部有膿包懷疑為結(jié)核結(jié)節(jié)，抹片鏡檢。根據(jù)剖檢結(jié)果，腸系膜充血、出血、潰瘍懷疑為黏膜病。全身主要臟器出血嚴重疑為敗血癥，進行細菌分離懷疑為巴氏桿菌。

圖1 肺水腫肝樣變Fig.1 Pulmonary edema liver sample

圖2 肺部表面疑似膿包Fig.2 Suspected pustules on the surface area of the lungs

圖3 腸系膜出血充血潰瘍Fig.3 Mesenteric congestion bleeding ulcer

圖4 腎表面出血Fig.4 Surface of renal hemorrhage

2.2 細菌分離結(jié)果

肺部膿包進行抗酸染色，鏡檢沒有保持紅色的抗酸性細菌，沒有結(jié)核桿菌、副結(jié)核桿菌。胃黏膜大量出血進行抹片檢查，并未分離出牛病毒性腹瀉病毒，即排除黏膜病的可能。

將內(nèi)臟病料接種于血液瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃下24 h以內(nèi)長出一種菌，菌落表面光滑，邊緣整齊，濕潤，呈灰白色、不溶血、很軟的大菌落。而在37℃下36 h長出另一種菌在血液平板上形成光滑、致密、濕潤、灰白色的針尖狀小菌落，菌落周圍呈現(xiàn)明顯的β溶血環(huán)[7]。采取病死牛肺病料，分別制成涂片與血液平板，用革蘭氏染色鏡檢，可在各病料涂片中均可見兩極濃染的革蘭氏陰性球狀桿菌。而另一個呈現(xiàn)革蘭氏陰性的小桿菌，菌體呈明顯的兩極濃染?；痉习褪蠗U菌與化膿隱秘桿菌的形態(tài)[8]。分別挑取單菌落，涂在新的血液平板上，將兩種菌純化出來之后分別進行涂片染色鏡檢，其中一個可見革蘭氏陽性棒狀桿菌，單在或成叢，無明顯鏈狀存在。進行細菌純化。

2.3 細菌鑒定結(jié)果

2.3.1 生化鑒定結(jié)果生化試驗結(jié)果（見表1、表2）。從表中可見，所分離的菌株其生化反應(yīng)結(jié)果符合巴氏桿菌與化膿隱秘桿菌所具備的生化特性。

表1 巴氏桿菌生化試驗結(jié)果Table 1 Pasteurella biochemical test results

表2 化膿隱秘桿菌生化試驗結(jié)果Table 2 Arcanobacterium pyogenes biochemical test results

2.3.2 PCR鑒定結(jié)果以提取化膿隱秘桿菌總DNA為模板，應(yīng)用P1和P2引物進行PCR擴增得到目的片段約為1 600 bp，巴氏桿菌kmt基因約為580 bp，其結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相似[9]，如下圖：

圖5 ?；撾[秘桿菌plo基因擴增結(jié)果Fig.5 Claves Arcanobacterium pyogenes plo gene amplification result

2.4 動物實驗結(jié)果

接種上清液的1號小白鼠，在接種后第四天死亡，3號小鼠于隔一天之后死亡，剖檢死亡小白鼠，采取小白鼠肺部觸片染色鏡檢看見兩極著色的單個或成雙存在的桿菌，死亡小白鼠肺臟接種與血液平板分離到灰白色、濕潤、光滑、隆起、邊緣整齊的菌落，革蘭氏染色細菌呈紅色小桿菌，單個或成雙存在，兩極著色。在這其中混雜幾個革蘭氏陽性的呈紫色的短桿菌，與之前分離出來的菌顏色形狀極其相似。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)過細菌分離實驗分離出的巴氏桿菌，根據(jù)其抑菌環(huán)大小，可以判斷出，它對鏈霉素極度敏感、對四環(huán)素、環(huán)丙沙星高度敏感，對阿奇霉素、阿莫西林、頭孢唑林中度敏感，而對丁胺卡那和新霉素不敏感。而由細菌分離實驗分離出的化膿隱秘桿菌，對頭孢呋肟、氨芐西林極度敏感，對四環(huán)素、氟苯尼考高度敏感，對丁胺卡那、多粘菌素中度敏感。

3 結(jié)論

根據(jù)臨床診斷包括流行病學(xué)檢查、臨床癥狀和剖檢變化；細菌的分離培養(yǎng)鑒定，生化試驗及動物試驗、PCR檢測為陽性。綜上所述可診斷出此病為化膿隱秘桿菌與巴氏桿菌混合感染，導(dǎo)致肺炎及敗血癥致死。

4 討論

化膿性隱秘桿菌為條件性病原菌，可引起化膿性肺炎[10]。巴氏桿菌雖不是條件性致病菌，但多殺性巴氏桿菌可存在于健康牛的上呼吸道，病是一種急性、熱性、出血性、敗血性傳染病，可引起纖維素性胸膜肺炎，病程短促[11]。這兩種疾病在臨床表現(xiàn)、病理變化等方面有著較為明顯的區(qū)別。研究中的發(fā)病犢牛的病程較長，病例零散發(fā)生，同一牛場的青年牛未發(fā)生此類疾病?；疾倥Ｔ谂R床癥狀、病理變化等方面所呈現(xiàn)的巴氏桿菌癥狀也不甚典型，而隱秘桿菌病臨床特征明顯，因此，確診此次犢牛發(fā)生的疾病為犢牛化膿性隱秘桿菌病，巴氏桿菌誘發(fā)繼發(fā)感染。

犢牛所帶的隱秘桿菌為出生后感染，其主要感染階段為生后1周，不及時預(yù)防會誘發(fā)巴氏桿菌繼發(fā)感染。因此，加強新生犢牛的飼養(yǎng)管理和疫病預(yù)防工作是防控本病的重點。建議從下幾個方面著手：第一，認真做好斷臍工作，切實做好臍帶斷端的消毒工作，因為臍帶感染可能是初生犢牛感染本病的一個途徑。第二，喂好初乳。第三，在發(fā)生該病的牛場，犢牛在出生后應(yīng)連續(xù)3～4 d注射對本菌敏感的抗生素，對預(yù)防本病發(fā)生有顯著效果。由于各奶牛場在治療牛病時習(xí)慣用的抗生素種類不盡相同，化膿性隱秘桿菌會形成不同的耐藥性，各牛場在針對本病進行預(yù)防時應(yīng)選用不同的抗生素，不可生搬硬套。

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Differential Diagnosis and Drug Sensitive Test for Pneumonia Outbreaks in Calves Group

Wu Dandan，Bai Yunlong，Li Xuechun，Zhou Jinling，Zhou Yulong
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In March 2015，a crop of calves broke out cough，and their head backed，jerked and dribbled at the mouth before they died in the Lindian county of Heilongjiang province.The results of necropsy of the dead calves showed that lesions mainly occurred in the lungs.Then pathologic materials were asepticlly collected to isolate and identify bacteria.The findings of the clinical examination，the biological characteristics and PCR assay of the obtained bacteria indicated that pneumonia of calves group was caused by mixed infection of pasteurella and arcanobacterium pyogenes，which resulted in the death of calves group.Animal experiments also showed that the pure cultures had high fatality rate in mice.Drug sensitive test suggested that these two kinds of bacteria were highly sensitive to streptomycin，ciprofloxacin，ampicillin and cephalosporins cefuroxime oxime，which provided reference to use drug in the clinic.

arcanobacterium pyogenes；pasteurell；diagnosis

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0092-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.019

2015-12-10

黑龍江省自然基金（QC2013C029）。

吳丹丹（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2014級碩士研究生。

周玉龍，男，副教授，E-mail：zhouyulong1980@163.com。