陳楠楠，葉麗麗，王華欣，祝婧，喬波，趙靜虎，劉通，岳山，周金玲，劉宇，朱戰(zhàn)波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所）

牛糞發(fā)酵沼液中產(chǎn)甲烷菌的分離及分子鑒定

陳楠楠1，2，葉麗麗1，王華欣1，祝婧1，喬波1，趙靜虎1，劉通1，岳山1，周金玲1，劉宇1，2，朱戰(zhàn)波1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江省獸醫(yī)科學研究所）

為了確定牛糞發(fā)酵沼液中疑似菌株的生物特性和種屬關(guān)系。采用Hungate滾管技術(shù)、厭氧培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、PCR擴增技術(shù)和抗生素耐受性鑒定等方法進行分析。實驗結(jié)果表明，牛糞發(fā)酵沼液分離到了一株革蘭氏陽性菌，能夠利用CO2，最適生長溫度為37℃，單獨或成對存在。菌落呈灰白色，光滑，表面凸起。PCR擴增出1 200 bp的16S rDNA片段，測序結(jié)果表明，該分離菌為產(chǎn)甲烷短桿菌。

產(chǎn)甲烷菌；厭氧培養(yǎng)；沼氣

產(chǎn)甲烷菌（methanogen）是一類以產(chǎn)生大量甲烷氣體作為能量代謝的終產(chǎn)物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環(huán)境中，如反芻動物的瘤胃和沼氣反應(yīng)器等人為環(huán)境中[1]，沼氣發(fā)酵過程是一個由多種微生物聯(lián)合，交替作用的復雜生化過程[2]。沼氣發(fā)酵微生物種類繁多，分為不產(chǎn)甲烷群落和產(chǎn)甲烷群落[3]，并且，在沼氣發(fā)酵過程中，產(chǎn)甲烷菌是關(guān)鍵微生物[4]。人們在以往有關(guān)沼氣發(fā)酵微生物的研究中重點關(guān)注沼氣發(fā)酵三個階段及各階段中不同微生物的作用[5-6]，發(fā)現(xiàn)沼氣發(fā)酵限速步驟是產(chǎn)甲烷階段[7]，而其中起主導作用的是產(chǎn)甲烷菌。產(chǎn)甲烷菌作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物鏈的最后一個成員，分析沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌的變化，對于自然界中的其他許多循環(huán)具有不可估量的推動力[8]。目前已知，自然環(huán)境中的微生物有90%～99%是還未可培養(yǎng)的，加之產(chǎn)甲烷菌的嚴格厭氧性、培養(yǎng)周期長等特點，使得通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術(shù)對產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)的分析十分困難，隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，特別是16S rDNA分析的方法引入?yún)捬醐h(huán)境微生物群落的研究中，使得快速、全面、準確地研究厭氧系統(tǒng)內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)的多樣性成為可能。對沼氣發(fā)酵池中的產(chǎn)甲烷菌進行研究，并通過傳統(tǒng)的Hungate滾管技術(shù)[9]和厭氧培養(yǎng)方法，從發(fā)酵液中分離產(chǎn)甲烷菌并進行鑒定，以期為有效控制沼氣發(fā)酵，減少溫室氣體的排放提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

沼液樣品采自黑龍江省某奶牛場糞污發(fā)酵池。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 普通培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2.2 產(chǎn)甲烷菌分離培養(yǎng)基[10]

NaCl0.1%，MgCl20.01%，K2HP040.04%，KH2P040.02%，酵母提取物0.2%，蛋白胨0.2%，半胱氨酸0.05%，甲酸鈉0.5%，乙酸鈉0.5%，甲醇0.35%，Na2S1%，NaHC035%，瓊脂粉，均購自哈爾濱賽拓有限公司。

固體培養(yǎng)基：添加0.5%瓊脂，在高壓滅菌（115℃，30 min）后，培養(yǎng)基使用前，每5 mL培養(yǎng)基中加入1%的Na2S和5%的NaHC03各0.1 mL。

1.3 產(chǎn)甲烷菌的分離純化

1.3.1 產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)基分離純化

試管中裝有5 mL融化的瓊脂培養(yǎng)基，冷卻至47℃左右時接種，在漩渦振蕩器上混勻，然后迅速（數(shù)秒鐘）在裝有冷水的燒杯中滾動，使瓊脂培養(yǎng)基在滾管中凝固，將凝固后的培養(yǎng)基立即放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中，抽真空，注入CO2，37℃厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，滾管壁上即可出現(xiàn)菌落，而后用接種環(huán)挑取單菌落放入新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，新培養(yǎng)的菌液經(jīng)過多次滾管和單菌落分離后即可得到純的菌株。

1.3.2 厭氧肉肝湯培養(yǎng)基分離純化

試管中裝有5 mL的厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，吸取沼液50 μL加入?yún)捬跞飧螠?，在漩渦振蕩器上混勻，加入500 μL液體石蠟，立即放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中，抽真空，注入CO2，37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后，試管中培養(yǎng)基變渾濁，而后吸取50 μL放入新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，新培養(yǎng)的菌液經(jīng)過多次分離后即可得到純的菌株。

1.4 產(chǎn)甲烷菌的生物特性鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察

將產(chǎn)甲烷菌進行革蘭氏染色，鏡檢觀察。

1.4.2 運動性觀察

直接滴加菌液至載玻片上，蓋上蓋玻片后，用顯微鏡直接觀察，可觀察到產(chǎn)甲烷菌的形態(tài)，以及是否具有運動性。

1.5 抗生素耐受性測定

1.5.1 藥物敏感試驗

產(chǎn)甲烷菌對于多種抗生素均有耐受性，試驗選取十種抗生素：多粘菌素B、大觀霉素、頭孢唑啉、阿莫西林、呋喃唑酮、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氯霉素、青霉素、鏈霉素與產(chǎn)甲烷菌進行試驗。首先將產(chǎn)甲烷菌涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，之后加入抗生素紙片，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)3 d，檢驗產(chǎn)甲烷菌的抗生素耐受性。

1.5.2 消毒劑殺菌試驗

研究選擇三種表面活性劑復配消毒劑[11]（實驗室研制）與產(chǎn)甲烷菌作用，首先，將0.2%濃度的表面活性劑4.5 mL，加入產(chǎn)甲烷菌液0.5 mL，作用1 h后，稀釋涂板，最后置于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)3 d，觀察表面活性劑與甲烷菌的殺菌作用。

1.6 產(chǎn)甲烷菌的16SrDNA序列的測定

1.6.1 菌液總DNA的提取

參考Esther M.Gabon的Blending method[12]和黃婷婷[13]的修正后的方法進行了操作。

1.6.2 產(chǎn)甲烷菌的16S rDNA的PCR擴增

根據(jù)Wright等人所報道的產(chǎn)甲烷菌16S rDNA特異性引物[14]，Met83F（5′-ACKGCTCAGTAACAC-3′），Met1340R（5′-CGGTGTGTGCAAGGAG-3′），選擇性擴增出產(chǎn)甲烷菌16S rDNA片段（擴增片段理論大小為1.2 kb），PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

反應(yīng)條件：首輪循環(huán)94℃預變性3 min；再接94℃變性30 s，59℃復性30 s，72℃延伸90 s，共30個循環(huán)，最后在72℃再延伸l0 min，擴增出1.2 kb的片斷。1.6.3 PCR擴增產(chǎn)物的回收與純化

用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收和純化DNA，操作步驟詳見北京索萊寶科技有限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒中的說明書。收集得到的DNA溶液一部分用瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收效果，剩余的DNA溶液放-20℃保存。

1.6.4 目的基因片段與pMD18-T載體連接

將回收并純化后的基因片段與pMD18-T載體進行連接，具體操作方法按照TaKaRa的pMD18-T Vector說明書進行。取一個PCR微量反應(yīng)管，依次向管中加入表2中所列出的各項試劑，上下顛倒混合均勻后瞬時離心，放16℃連接儀中連接10 h。

表2 連接反應(yīng)體系Table 2 Ligation reaction system

1.6.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

將pMD18-T連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化進E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，具體操作方法按照BMDH5α感受態(tài)細胞使用說明書進行。

1.6.6 16SrDNA的序列測定

以pMD18-T Vector上的經(jīng)PCR鑒定正確的菌確定為pMD18-T陽性克隆菌，將陽性克隆菌的菌液與50%甘油1∶1混合，裝入1.5 mL離心管中，用封口膜封口，一部分送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，另一部分保存于-80℃冰箱中備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)甲烷菌的分離純化結(jié)果

2.1.1 產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)基分離純化

利用產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基，經(jīng)過嚴格厭氧培養(yǎng)7 d，試管中有氣體產(chǎn)生，并帶有刺激性氣味，菌落呈灰白色，表面凸起，革蘭氏染色陽性，菌體呈短桿狀，成對或多個相連，能夠利用CO2，最適生長溫度為37℃。

2.1.2 厭氧肉肝湯培養(yǎng)基分離純化

利用厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，經(jīng)過嚴格厭氧培養(yǎng)4 d，試管中有氣體產(chǎn)生，試管顏色變深，底部有白色沉淀產(chǎn)生，帶有刺激性臭味，在營養(yǎng)瓊脂板中生長良好，菌落呈灰白色，光滑，表面凸起，革蘭氏染色陽性，菌體成對存在，能夠利用CO2，最適生長溫度為37℃。

產(chǎn)甲烷菌屬于嚴格厭氧菌，很難被分離出來，由以上培養(yǎng)結(jié)果可以看出，產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)必須在嚴格厭氧的條件下，且能夠利用CO2，才有可能被培養(yǎng)、分離出來。采用Hungate滾管技術(shù)分離純化，與厭氧肉肝湯培養(yǎng)相比較，培養(yǎng)時間稍長些，但是菌落生長較好。

2.2 產(chǎn)甲烷菌的生理生化鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察

產(chǎn)甲烷菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，一般單獨或成對存在，菌落呈灰白色，表面凸起。

2.2.2 運動性觀察結(jié)果

產(chǎn)甲烷菌鏡檢觀察無鞭毛、無莢膜、沒有運動性。

2.3 抗生素耐受性測定結(jié)果

2.3.1 藥物敏感試驗結(jié)果

試驗選擇多粘菌素B、大觀霉素、頭孢唑啉、阿莫西林、呋喃唑酮、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氯霉素、青霉素、鏈霉素與產(chǎn)甲烷菌進行藥物敏感性試驗，檢驗產(chǎn)甲烷菌的耐受性。結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷菌對多粘菌素B，大觀霉素，頭孢唑啉，阿莫西林，氯霉素，青霉素敏感，對呋喃唑酮、鏈霉素耐藥（見表3）。

表3 藥物敏感試驗Table 3 Drug sensitivity test

2.3.2 表面活性劑試驗結(jié)果

試驗選擇Gemini+戊二醛、Gemini+醋酸氯已定、Gemini+二硫氰基甲烷，三種新型消毒劑與產(chǎn)甲烷菌作用，檢測新型消毒劑對產(chǎn)甲烷菌的殺菌效果。結(jié)果表明，Gemini+戊二醛消毒劑在60 min作用時間下，可有效殺滅產(chǎn)甲烷菌，而Gemini+醋酸氯已定、Gemini+二硫氰基甲烷消毒劑在同樣的作用時間下不能殺滅產(chǎn)甲烷菌，由此可以看出，Gemini+戊二醛消毒劑對產(chǎn)甲烷菌有一定殺滅作用。（見表4）。

表4 消毒劑殺菌試驗結(jié)果Table 4 Disinfectant test results

2.4 PCR擴增結(jié)果

以產(chǎn)甲烷菌16S rDNA特異性引物通過PCR擴增出產(chǎn)甲烷菌1 200 bp的16S rDNA片段（見圖1）。

圖1 PCR鑒定電泳圖譜Fig.1 PCR electrophoresis patterns identified

由圖5可見，擴增大小與設(shè)計時的大小結(jié)果一致，約為1 200 bp，目的片段擴增的成功與否取決于反應(yīng)體系、溫度、擴增參數(shù)、引物設(shè)計等方面，試驗成功擴增出了目的片段，說明上述條件都符合甲烷菌特異片段擴增的要求。

2.5 16SrDNA的序列測定結(jié)果

連接到pMDl8-T Vector上的16S rDNA，以特異性測序引物Met83F（5′-ACKGCTCAGTAACAC-3′），Met1340R（5′-CGGTGTGTGCAAGGAG-3′）測序，并將結(jié)果進行序列比對，結(jié)果該序列甲烷菌與Methanobrevibacter sp.R4C序列比對結(jié)果為相似率100%，并且無基因突變（見圖2）。

圖2 產(chǎn)甲烷菌16S rDNA序列比對結(jié)果Fig.2 Methanogenic bacteria 16SrDNA sequence alignment results

2.6 16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹

產(chǎn)甲烷菌16S rDNA序列用Blast軟件與GENEBANK數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行同源性比較，利用Bayes軟件包中程序生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹（見圖3）。

以傳統(tǒng)的Hungate滾管技術(shù)和厭氧培養(yǎng)方法，從牛糞沼氣池中分離到一株產(chǎn)甲烷菌-圖中的83F，通過鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示，該菌株確定為Methanobrevibacter sp，鑒定的結(jié)果與前一部分分子生物學方法所得到的結(jié)果一致。

3 討論

近年來，由于甲烷是僅次于二氧化碳的一種不容忽視的溫室氣體，有關(guān)產(chǎn)甲烷菌的研究因而日益受到重視。嚴格的厭氧條件是產(chǎn)甲烷細菌分離成敗的關(guān)鍵，產(chǎn)甲烷細菌遇氧后其生長會受到抑制，失去活性。所以密封的培養(yǎng)容器和操作過程的嚴格厭氧是整個試驗成功的關(guān)鍵。為此，厭氧箱中需用高純CO2等來驅(qū)除氣相中的空氣。

圖3 基因文庫中與產(chǎn)甲烷菌相關(guān)的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.3 Gene library with methanogens related 16S rDNA phylogenetic tree

使用現(xiàn)有的亨蓋特滾管分離純化培養(yǎng)技術(shù)，通過改變底物成分或添加化學抑制劑仍被作為研究產(chǎn)甲烷菌代謝特性并實現(xiàn)分離純化產(chǎn)甲烷菌的主要途徑。采用此方法從沼液中分離出產(chǎn)甲烷細菌，但是此方法分離出的產(chǎn)甲烷菌比較少，而且過程比較煩瑣。因此，采用厭氧肉肝湯培養(yǎng)基進行厭氧培養(yǎng)，同樣，分離出一株產(chǎn)甲烷菌，通過初步的形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA分析等方法進行鑒定，結(jié)果，該菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，一般成對存在，能夠利用CO2，最適生長溫度為37℃，經(jīng)PCR鑒定，目的片段為1 200 bp，測序鑒定結(jié)果為產(chǎn)甲烷短桿菌。因此，確定該菌為一株產(chǎn)甲烷短桿菌，該甲烷菌對多粘菌素B、大觀霉素、頭孢唑啉、阿莫西林敏感、氯霉素、青霉素敏感，表面活性劑Gemini+戊二醛消毒劑在60 min作用時間內(nèi)即可殺滅產(chǎn)甲烷菌。

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Molecular Identification of Methanogens Isolated from Biogas Slurry Fermented with Cow Dung

Chen Nannan1，2，Ye Lili1，Wang Huaxin1，Zhu Jing1，Qiao Bo1，Zhao Jinghu1，Liu Tong1，Yue Shan1，Zhou Jinling1，Liu Yu1，2，Zhu Zhanbo1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；
2.Veterinary Science Research Institute of Heilongjiang Province）

Biological characteristics and relationship between species of Methanogens in biogas slurry fermented with cow dung were researchedbyHungaterolling-tubetechnique，anaerobicculturemethod，Gram'smethod，PCRandAntibioticresistance identification.Results showed that a gram-positive isolated bacteria was able to take advantage of the CO2，growth temperature was 37℃，existed alone or in pairs.Colonis were pale，smooth and convex.PCR results showed that 16SrDNA fragments of 1 200 bp were amplified，isolated bacteria was identified as Methanogens by DNA sequencing technology.

methanogens；anaerobic cultivation；biogas slurry

S216.4

A

1002-2090（2016）06-0117-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.024

2015-10-11

國家科技支撐計劃課題（2013BAD21B01-1）。

陳楠楠（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院2013級碩士研究生。

朱戰(zhàn)波，男，教授，博士研究生導師，E-mail：zhanbozhu@163.com。