楊延巍 劉彥虹

液體活檢在常見腫瘤中的應(yīng)用

楊延巍 劉彥虹

目前治療腫瘤的手段多種多樣，已經(jīng)不完全局限于傳統(tǒng)的手術(shù)切除及放化療等，分子靶向治療藥物的普及使“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”正逐步被應(yīng)用到臨床腫瘤領(lǐng)域。腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)將個體疾病的遺傳學(xué)信息、診斷、治療三者結(jié)合，使腫瘤的診治更具有針對性、靶向性和特異性。液體活檢是一種新興的無創(chuàng)檢測技術(shù)，該項技術(shù)是通過采集患者體液（包括血液、唾液、汗液及分泌物等）對體內(nèi)的腫瘤或移植器官狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測的方法。了解和臨床應(yīng)用這項檢測技術(shù)對腫瘤的診斷尤為凸顯。本文綜述了液體活檢的生物學(xué)特性及其在常見腫瘤精準(zhǔn)治療的應(yīng)用。

惡性腫瘤； 應(yīng)用； 液體活檢； 循環(huán)腫瘤細(xì)胞； 循環(huán)腫瘤DNA； 精準(zhǔn)醫(yī)療

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的一類疾病，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。腫瘤治療前需要一個精確的組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷來確定治療方式。目前常用的組織活檢是有創(chuàng)的、局限的。近年來腫瘤分子生物學(xué)發(fā)展起來的液體活檢，具有無創(chuàng)、全面、反復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢，對早期發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移、靶向治療和療效以及預(yù)后判斷具有重要意義［1］。液體活檢主要包括循環(huán)腫瘤DNA（circulatin umor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatin umor cells，CTC）、外泌體檢測等，目前對ctDNA和CTC研究較多。2016年1月，國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了首個CTC檢測試劑盒，液體活檢技術(shù)正式應(yīng)用于臨床。

一、常見的幾種液體活檢的技術(shù)方法

（一）循環(huán)腫瘤DNA檢測

循環(huán)游離DNA（circulatin ell-free DNA，cfDNA）是存在于血液、腦脊液等體液中的一種胞外DNA，以單鏈或者雙鏈DNA、DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物等形式存在，大小為150～210 000 bp［2］。1948年Mandel和Metais［3］首次在健康人血中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)游離DNA（ctDNA）。而癌癥患者的循環(huán)DNA于1977年才發(fā)現(xiàn)。對于癌癥患者而言，cfDNA不僅來源于體內(nèi)凋亡的細(xì)胞釋放DNA入血，也來源于脫離腫瘤組織入血的CTC，這種來源于腫瘤細(xì)胞的DNA被稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。健康人體內(nèi)巨噬細(xì)胞和溶酶體的清除作用，使其血液中的cfDNA含量維持在較低水平［4］。腫瘤細(xì)胞呈指數(shù)增長，大量癌細(xì)胞播散及壞死所釋放的核酸超過機(jī)體正常的清除能力，癌癥患者ctDNA升高，因此ctDNA可以鑒別腫瘤細(xì)胞［5］。

（二）循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特點

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是異常的腫瘤細(xì)胞或微小血栓，來自于原位腫瘤細(xì)胞脫落或者是腫瘤轉(zhuǎn)移至血道的細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，大部分因機(jī)體的免疫系統(tǒng)或機(jī)械作用而損傷，或者因其自身凋亡短期內(nèi)死亡，只有很少一部分具有高活力和高轉(zhuǎn)移潛能CTCs能夠存活下來，并在遠(yuǎn)處臟器中定植，發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶［6-7］。Driemel等［8］發(fā)現(xiàn)處于增殖期的癌細(xì)胞高表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子（epithelia ell adhesio olecule，EpCAM），EpCAM低表達(dá)則可抑CTCs的增殖。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)存在于外周血中呈孤立狀態(tài)者的CTCs多處于凋亡狀態(tài)，而CTCs細(xì)胞簇中并沒有此現(xiàn)象［9-10］，說明以細(xì)胞簇狀態(tài)聚集存在的CTCs可避免“失巢凋亡”，并且對細(xì)胞毒性藥物具有更高的耐受性。

（三）小分子核糖核酸

小分子核糖核酸（microRNA）是小的非編碼單鏈RNA，約19到22個核苷酸長度，作為沉默RNA，反向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)水平［11］。MicroRNA有多個細(xì)胞功能，如生長、增殖、新陳代謝及細(xì)胞凋亡。mRNA的作用首次在慢性淋巴細(xì)胞白血病中顯示出來［12］，迅速生長的個體證明了他們的起源和腫瘤多形態(tài)的進(jìn)展，包括肺癌［13］。在創(chuàng)新性研究中，Lu等［14］首先強(qiáng)調(diào)了MicroRNA在腫瘤學(xué)中診斷生物標(biāo)志物具有潛在作用。因此MicroRNA分子可以幫助癌癥患者的診斷、預(yù)測和預(yù)后。血清MicroRNA具有的幾個優(yōu)勢：穩(wěn)定、組織特異性表達(dá)或生物特異性表達(dá)，容易檢測［15］。然而，MicroRNA作為生物標(biāo)志物，其診斷、預(yù)后、個性化治療和疾病管理仍處于初始階段。

二、液體活檢在腫瘤精準(zhǔn)診斷和治療中的應(yīng)用

（一）結(jié)直腸腫瘤

ctDNA水平對腫瘤高危人群的早期篩查和腫瘤早期診斷具有重要意義，還可檢測腫瘤基因中特定位置的基因缺陷，對臨床晚期患者應(yīng)用靶向藥物治療具有指導(dǎo)意義，并且可以監(jiān)測預(yù)后。Jahr［16］通過檢測結(jié)腸癌和健康人中的血清DNA水平和CEA水平，表明結(jié)腸癌患者ctDNA水平比健康人明顯升高。Grutzmann等［17］與Warren等［18］對不同分期CRC患病人群開展回顧性研究，對比血漿ctDNA中甲基化SEPT9基因（mSEPT9）水平，結(jié)果顯示，SEPT9基因異常甲基化對CRC診斷的敏感度為72～90%，特異度為88～90%。Allegra等［19］指出用抗EGFR抗體藥物治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時，患者要進(jìn)行腫瘤基因型測試，當(dāng)檢測出KRAS 12或13號密碼子基因突變時，應(yīng)避免使用抗EGFR抗體對其進(jìn)行治療，選用EGFR單抗（西妥昔單抗或帕尼單抗）對其進(jìn)行治療有效。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中使用定量PCR檢測ctDNA中KRAS突變水平，低水平的KRAS突變說明使用第三代西妥昔單抗和伊立替康治療后可以穩(wěn)定疾病狀態(tài)。高濃度血漿KRAS和BRAF突變提示結(jié)直腸癌靶向治療后預(yù)后不良。

（二）乳腺癌

循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的一部分細(xì)胞可能發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelia esenchyma ransition，EMT），造成上皮細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物丟失，間質(zhì)細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志物呈高表達(dá)狀態(tài)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)會增加［20-23］，因此CTC可以用來監(jiān)測乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移。Aktas等［24］研究轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血中CTCs時發(fā)現(xiàn)，Twist1、蛋白激酶B以及磷脂酰肌醇-3激酶α等EMT相關(guān)的分子標(biāo)志物均有不同程度的表達(dá)升高。Papadaki等［25］通過免疫熒光共定位分析發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）和Twist在乳腺癌不同階段中的表達(dá)水平也不同，在早期乳腺癌患者的CTCs中，ALDH1呈低表達(dá)或者陰性，Twist多呈陰性且主要定位于胞質(zhì)；而在乳腺癌晚期且發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的CTCs中，ALDH1則呈高表達(dá)，Twist主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，且兩者多共定位于同一細(xì)胞內(nèi)。

（三）肺癌

miRNA可以區(qū)分肺癌和正常組織［26-27］，小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌，腺癌和鱗狀細(xì)胞癌［28-29］。循環(huán)miRNA，主要檢測早期非小細(xì)胞肺癌，并作為早期的潛在生物標(biāo)志物檢測疾病的復(fù)發(fā)［30-31］。Shen等［32］報道，非小細(xì)胞肺癌患者和健康對照組的miR-21，miR-126，miR-210和miR-486-5-p的敏感性和特異性分別為86%和96%。miR的表達(dá)可以在肺癌根治性切除術(shù)后發(fā)生改變［33-36］。Le等［35］研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤miR的表達(dá)可以發(fā)生改變，miR-21，miR-205，miR-30d，miR-24的表達(dá)增加，Aushev等［36］研究顯示miR-205，miR-19a，miR-19b，miR-30b，miR-20a的表達(dá)增加。CTC計數(shù)還可以反映患者對治療的反應(yīng)。研究顯示，小細(xì)胞肺癌化療后較化療前CTC計數(shù)明顯減少，且化療后CTC計數(shù)與臨床預(yù)后和死亡風(fēng)險呈顯著相關(guān)，證明CTC計數(shù)對擴(kuò)散性小細(xì)胞癌患者預(yù)后有顯著意義［37］。用分離的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的外周血CTC進(jìn)行EGFR突變和酪氨酸激酶抑制劑耐藥相關(guān)基因檢測，檢出率可高達(dá)92%，且對分子靶向藥物使用具有良好指導(dǎo)作用［38］。

三、液體活檢技術(shù)的優(yōu)勢與展望

循環(huán)腫瘤DNA檢測通過采集患者外周血，即可獲得體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的基因組信息，是一種突破性的革新技術(shù)。與傳統(tǒng)的穿刺活檢等方法比較，液體活檢具有以下獨(dú)到的優(yōu)勢：（1）無創(chuàng)，重復(fù)性好。對于晚期或不宜手術(shù)患者，可以再次或多次取材，監(jiān)測腫瘤細(xì)胞；（2）取樣全面，避免腫瘤異質(zhì)性帶來的取樣不全；（3）精準(zhǔn)，直接獲得腫瘤基因組信息，同時用于指導(dǎo)后續(xù)靶向治療；（4）早期血液中獲得CTC和ctDNA由其本身的生物學(xué)特性（半衰期都在24 h之內(nèi)）是最新鮮、實時的；（5）多種基因聯(lián)合篩查可以提高敏感度及特異度。

目前為止，對CTCs的研究多為臨床研究，且大多只停留在外周血CTCs計數(shù)的層面，而對其生物學(xué)特性以及基因型和表型的變化等基礎(chǔ)研究則相對較少，對其更深層次的認(rèn)識相對不足。隨著對CTCs研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)CTCs的生物學(xué)特性以及基因型和表型的變化有助于了解其在腫瘤耐藥以及轉(zhuǎn)移等方面的作用，為腫瘤早期診斷、個體化治療方案的選擇、預(yù)后評估以及癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險預(yù)測等提供更可靠的依據(jù)，甚至能為癌癥的治療帶來新的方法?？傊?，CTCs的研究有著很好的應(yīng)用前景，并能為腫瘤研究的領(lǐng)域提供新的研究方向。

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The application of liquid biopsy in common tumors

Yang Yanwei, Liu Yanhong.
Department of Clinical Laboratory, Second Aff i liated Hospita f Harbin Medical University, Harbin 150086, China
Correspondin uthor: Liu Yanhong, Email: liuusa2016@163.com

Nowadays, ther r an ifferen ethod o h reatmen ancer, suc s traditiona urgica esectio n adiotherap n hemotherapy. Th opularizatio olecula argeted therap rug a raduall ee pplie h iel linica ncology. Tumo recisio edicin an combin it ndividua iseas eneti nformation, diagnosi n reatment, s ha h iagnosi nd treatment of cancer is more targeting and specif i city. Liquid biopsy is a new noninvasive detection technique tha se onito h tat tumo ransplante rga patien ollectin od luid (includin lood, saliva, sweat, an ecretions). Knowin n pplyin hi etectio echnolog linical i articularl rominen h iagnosi h umor. Thi ape eviewe h iologica haracteristic f liquid biopsy and its application in the treatment of common tumors.

Malignan umor; Application; Liquid biopsy; Circulatin umo ells; Circulating tumor DNA; Precisio edicine

2017-01-19）

（本文編輯：趙志勛）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.02.011

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科

劉彥虹，Email：liuusa2016@163.com