王永清，林彬輝，蔡劍偉，張琪，陳曉燕

（漳州市公安局刑偵支隊(duì)，福建漳州 363000）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

現(xiàn)場(chǎng)大量生物檢材的自動(dòng)化提取應(yīng)用

王永清，林彬輝，蔡劍偉，張琪，陳曉燕

（漳州市公安局刑偵支隊(duì)，福建漳州 363000）

法醫(yī)遺傳學(xué)；提取法；自動(dòng)化；微量物證

隨著司法訴訟進(jìn)程對(duì)證據(jù)質(zhì)量要求的不斷提高，重特大案件的現(xiàn)場(chǎng)重建直接導(dǎo)致生物檢材的送檢量大幅度提升，時(shí)效要求也越來越高。而現(xiàn)場(chǎng)送檢的生物檢材種類繁多，以往應(yīng)用Chelex-100法手工操作耗時(shí)長(zhǎng)、易污染，手工磁珠法無法批量進(jìn)行，傳統(tǒng)方式已無法適應(yīng)形勢(shì)的要求[1]，尋求高通量的生物檢材DNA自動(dòng)化提取應(yīng)用已迫在眉睫。本研究通過采用AutoLys STAR自動(dòng)化工作站結(jié)合微量檢材DNA提取試劑盒建立生物檢材DNA自動(dòng)化檢驗(yàn)體系，以實(shí)現(xiàn)批量的自動(dòng)化操作，杜絕交叉污染，有效提升檢案的效率和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 樣本

本實(shí)驗(yàn)室日常受理檢驗(yàn)的案件生物檢材1552份，其中包括血痕813份，煙蒂237份，混合斑78份，肋軟骨27份，帶毛囊毛發(fā)11份，頭套、手套、口罩、衣服、帽子、瓶口、杯口、果核、牙刷、觸摸類（含工具、把手、線頭、印痕）等接觸細(xì)胞檢材386份。

1.2 儀器和試劑

AutoLys STAR自動(dòng)化工作站（瑞士Hamilton公司），9700型PCR擴(kuò)增儀、3130xl型遺傳分析儀、Gene-Mapper ID v3.2軟件（美國(guó)AB公司）。Identifiler?Plus試劑盒（美國(guó)AB公司），脫落細(xì)胞提取儀（公安部物證鑒定中心），EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器（公安部物證鑒定中心，以下簡(jiǎn)稱EZ-tape），微量檢材DNA提取試劑盒（煙臺(tái)澳斯邦生物研發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 檢材處理

血痕、煙蒂、肋軟骨、帶毛囊毛發(fā)、口罩：剪取或切取適量檢材，置入AutoLys Tube管（AutoLys STAR自動(dòng)化工作站專用裂解管）。

混合斑：剪取檢材適量，使用差異裂解法去除女性物質(zhì)，將沉渣用50μL純水混勻后加入1mol/L DTT 10μL，置入AutoLys Tube管。

頭套、手套、帽子：用EZ-tape粘取，揭下基座上的膠帶置入AutoLys Tube管。

衣服：用脫落細(xì)胞提取儀吸取衣領(lǐng)和袖口處，剪取第二層濾膜置入AutoLys Tube管。

瓶口、杯口、果核、牙刷：采用干濕兩步法，直接用棉簽提至AutoLys Tube管中。

觸摸類：先用棉簽干濕兩步法擦拭，再用EZ-tape粘取，揭下基座上的膠帶置入AutoLys Tube管。1.3.2 DNA提取

編寫檢材登記表，掃描裂解管底部二維碼，登記對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)，填寫樣本的洗脫體積和PCR建立時(shí)需要分配的對(duì)應(yīng)樣本的DNA溶液模板體積。將裝有檢材的AutoLys Tube管依次放入對(duì)應(yīng)載架上。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及其分型

采用10 μL體系的Identifiler?Plus試劑盒在9700型PCR擴(kuò)增儀上按標(biāo)準(zhǔn)程序29個(gè)循環(huán)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，其中Master Mix 4μL、Primer Set 2μL、模板2μL、超純水2μL。在3130xl型遺傳分析儀上進(jìn)行電泳檢測(cè)，用GeneMapper ID v3.2軟件進(jìn)行分析。該試劑盒可以對(duì)共15個(gè)STR基因座進(jìn)行分型檢測(cè)，本次以獲得性別及13個(gè)以上STR基因座明確分型的為成功[2-5]。

2 結(jié)果

1552例生物檢材總STR檢測(cè)成功率為90.40%。其中肋軟骨、毛發(fā)成功率為100.00%；血痕、煙蒂、瓶口等檢材成功率也較高；頭套、手套、口罩、衣服、帽子、瓶口、杯口、果核、牙刷、觸摸類等多類接觸細(xì)胞平均檢出率為68.91%，其中觸摸類檢材成功率則較低（表1）。

表1 采用自動(dòng)化工作站提取生物檢材DNA的檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

自動(dòng)化工作站為常見生物性檢材的DNA提取提供了一個(gè)高效、精確、有用的平臺(tái)[6]，已在人員血樣DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)中起著重要作用[7]。而基于功能磁性納米顆粒的樣本提取與處理技術(shù)（即磁珠分離技術(shù)）可以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定，避免人工操作引起的誤差[8]。將自動(dòng)化工作站與磁珠法DNA提取技術(shù)相結(jié)合的磁珠DNA自動(dòng)提取系統(tǒng)正逐步普及，已在法醫(yī)應(yīng)用DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)和案件檢驗(yàn)中得到應(yīng)用。

AutoLys STAR自動(dòng)化工作站的試劑平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)程序均為開放式，可兼容包括市面上各種磁珠試劑在內(nèi)的多種常見提取方法，未來DNA檢驗(yàn)新方法同樣可在該平臺(tái)得到應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)案例檢驗(yàn)采用的微量檢材DNA提取試劑盒中磁珠顆粒較小、吸附效率高，適用于法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室常見生物檢材的提取。微量檢材DNA提取試劑盒配合AutoLys STAR自動(dòng)化工作站可自動(dòng)完成樣本裂解、磁珠吸附、洗滌和洗脫純化步驟，樣本完全閉蓋裂解，杜絕交叉污染，無需人工進(jìn)行離心、過濾等操作，在本實(shí)驗(yàn)中得到了較理想的檢出效率。隨著犯罪分子反偵查意識(shí)不斷增強(qiáng)，案件現(xiàn)場(chǎng)遺留的常規(guī)檢材越來越少，辦案人員逐漸將勘查重點(diǎn)轉(zhuǎn)向微量物證，而這類檢材的檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)案件定性乃至偵破起著關(guān)鍵作用。該工作平臺(tái)加入了超濾步驟，使模板得到充分富集、濃縮，在本實(shí)驗(yàn)中針對(duì)接觸類檢材，特別是觸摸類檢材的檢出率同比本實(shí)驗(yàn)室以往檢測(cè)、高林林等[4-5]檢測(cè)結(jié)果均有大幅提升。

在使用該工作平臺(tái)中我們發(fā)現(xiàn)，該平臺(tái)確能實(shí)現(xiàn)大通量檢驗(yàn)的目的，對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)大量生物檢材的送檢，操作人員只需將樣本檢材放入指定位置，啟動(dòng)軟件即可自動(dòng)完成DNA提取，實(shí)現(xiàn)了全系統(tǒng)的自動(dòng)化，無需再行人工干預(yù)，有效節(jié)約了寶貴的人力；同時(shí)，該平臺(tái)還引入了二維碼，避免了人為差錯(cuò)，可保證檢材從進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室到得出DNA檢驗(yàn)結(jié)果，中間每一步過程都有記錄，都可以得到追溯，適應(yīng)了當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室開展認(rèn)可與資質(zhì)認(rèn)定工作的要求。

綜上所述，本研究利用自動(dòng)化工作站建立的標(biāo)準(zhǔn)化流程，可以批量提取常見案件中生物檢材DNA，特別是應(yīng)用于侵財(cái)類案件普遍送檢接觸類檢材的提取，不僅具備高效、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、有效防控污染等特點(diǎn)[9]，減少人力資源，易于實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化和自動(dòng)化，且該自動(dòng)化工作站為模塊化設(shè)計(jì)，便于后期根據(jù)工作需求進(jìn)行升級(jí)，可在常規(guī)檢案之外的檢測(cè)工作中得到便捷應(yīng)用。

[1]匡金枝，聶同鋼，楊智，等.法醫(yī)物證DNA自動(dòng)化檢驗(yàn)技術(shù)體系的研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（3）：165-167.

[2]中華人民共和國(guó)公安部.人類DNA熒光標(biāo)記STR分型結(jié)果的分析及應(yīng)用：GA/T 1163—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[3]劉亞舉，張麗娟.自動(dòng)化工作站批量提取現(xiàn)場(chǎng)生物檢材DNA的應(yīng)用[J].刑事技術(shù)，2014，（2）：60-61.

[4]高林林，洪亮，葉慧薇，等.脫落上皮細(xì)胞類生物檢材的自動(dòng)化提取[J].刑事技術(shù)，2011，（2）：14-15.

[5]王琴，章申峰，李佑英，等.微量脫落細(xì)胞DNA檢驗(yàn)方法的比較分析[J].刑事技術(shù)，2014，（4）：54-55.

[6]張瓊予，丁梅，王保捷，等.DNA提取自動(dòng)化工作站在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（1）：40-42.

[7]劉莉，王衛(wèi)華，唐劍鋒.磁珠法在自動(dòng)化核酸提取工作站中的應(yīng)用[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（2）：144.

[8]易勇，敬華.免疫磁珠分離技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].總裝備部醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（4）：239-241.

[9]孫大成，孫善永，姜曜恒，等.應(yīng)用自動(dòng)化工作站批量提取生物檢材DNA[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（1）：54-55.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.016

1004-5619（2016）06-0455-02

2016-05-10）

（本文編輯：張素華）

王永清（1973—），男，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)檢案和研究；E-mail：vt73@163.com