李進(jìn)讓 田師宇 鄒世楨 劉濤 于磊 王文軍

·論著·

健康成年人唾液中胃蛋白酶含量測(cè)定在輔助檢測(cè)咽喉反流中的應(yīng)用研究

李進(jìn)讓1田師宇1鄒世楨1劉濤2于磊2王文軍3

目的初步探索健康成年人唾液中胃蛋白酶含量范圍，為臨床檢測(cè)、診斷咽喉反流性疾病提供參考依據(jù)。方法2016年9月1日～9月30日在海軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診招募50名健康成年人作為受試者，收取受試者晨起空腹情況下黏白唾液，封存于1.5 ml無菌EP管內(nèi)，并在30min內(nèi)將EP管放置于-28℃冰箱中冷凍，最長(zhǎng)冷凍時(shí)間不超過2周；采用人胃蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定受試者唾液中胃蛋白酶含量。結(jié)果50名健康受試者晨起痰液中胃蛋白酶含量為（24.22 ±6.94）ng/ml，95%CI為（22.18，26.06）ng/ml。 其中，男性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（22.78 ±1.35）ng/ml，95%CI為（20.00，25.57）ng/ml；女性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（25.67 ±1.39）ng/ml，95%CI為（22.80，28.54）ng/m l。結(jié)論健康成年人唾液中存在一定含量的胃蛋白酶，檢測(cè)唾液胃蛋白酶含量有望用于咽喉反流性疾病的診斷。

胃；蛋白酶； 咽喉； 參考值

臨床中以咽部異物感、慢性咳嗽、頻繁清嗓、發(fā)音異常、吞咽不適等主訴就診的患者在耳鼻喉科門診就診患者中占50%以上，常診斷為慢性咽喉炎（Chronic pharyngitis），且常規(guī)咽炎藥物治療效果欠佳[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的發(fā)展，診療技術(shù)的不斷完善，咽喉反流（laryngopharyngeal reflux，LPR）逐步被人們所認(rèn)知，其主因是食管上下括約肌功能障礙導(dǎo)致的胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位引起咽喉部粘膜的損傷，從而出現(xiàn)聲音嘶啞、頻繁清嗓、咽喉部異物感等癥狀。國(guó)內(nèi)外已有眾多相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)咽喉反流的發(fā)病率為3.86%～34.39%，甚至更高[2-4]。在咽部異感癥、發(fā)音障礙、睡眠呼吸功能障礙等患者中存在咽喉反流相關(guān)問題，咽喉反流也是任克間隙水腫、喉狹窄、喉接觸性肉芽腫、喉癌等多種疾病的致病因素之一。對(duì)于此類患者，目前國(guó)內(nèi)多采用診斷性治療，即對(duì)疑似咽喉反流的患者給予一段時(shí)間的規(guī)律抑制胃酸治療，通過驗(yàn)證其是否有效，以判斷咽喉反流的存在，此法在對(duì)疾病診斷的同時(shí)又起到治療作用，但不足之處在于其療效帶有較大的主觀性，缺乏判斷療效的客觀指標(biāo)，確診耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)等。目前對(duì)于咽喉反流的客觀診斷主要是24h多通道腔內(nèi)阻抗-雙探針pH值監(jiān)測(cè)，但該方法為有創(chuàng)檢查，且必須在醫(yī)院進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)此法在國(guó)內(nèi)耳鼻咽喉頭頸外科并不普及，同時(shí)尚沒有達(dá)成統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，這也給咽喉反流相關(guān)疾病患者在臨床診療方面增加了不確定性[5]，故迫切需要一種行之有效，簡(jiǎn)單便捷的方法對(duì)其進(jìn)行診斷，目前國(guó)際上研究熱點(diǎn)主要是對(duì)唾液胃蛋白酶的研究[6-8]，其旨在通過唾液胃蛋白酶檢測(cè)，為證實(shí)咽喉反流的存在提供客觀依據(jù)，并得到了相關(guān)學(xué)者的認(rèn)可。但目前該方法僅停留在臨床研究階段，并未投入臨床實(shí)際當(dāng)中[6，7]，同時(shí)目前國(guó)內(nèi)對(duì)于健康成年人唾液中胃蛋白酶含量值鮮有報(bào)道，故本研究通過檢測(cè)健康成年人群中唾液胃蛋白酶含量以為臨床診斷咽喉反流性疾病奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般資料

招募健康受試者50名，男女各半，25名男性受試者中，年齡（29.36±6.82）歲，RSI 0～7分，中位數(shù)3分；25名女性受試者中，年齡（28.04±6.40）歲，RSI 0～8分，中位數(shù)1分。受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80周歲；知情同意及自愿參與本研究；配合填寫反流癥狀指數(shù)量表（RSI），且評(píng)分＜13分者。排除標(biāo)準(zhǔn)：目前或兩周內(nèi)患有口腔、咽喉、食管及胃部疾病的對(duì)象；RSI表評(píng)分＞13分者。

二、方法

1.唾液收取方法

囑受試者前一天晚餐以清淡飲食為主，零點(diǎn)以后禁食禁水，由項(xiàng)目研究者本人逐一收取受試者第二天晨起6∶00～8∶00空腹情況下黏白唾液，封存于1.5 ml無菌EP管內(nèi)，并在30 min內(nèi)將EP管放置于-28℃冰箱中冷凍，最長(zhǎng)冷凍時(shí)間不超過2周，以保證胃蛋白酶的穩(wěn)定性和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.實(shí)驗(yàn)材料

受試者唾液；酶標(biāo)儀（SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices，美國(guó)）；恒溫培養(yǎng)箱（SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器，浙江金壇科析儀器有限公司生產(chǎn)）；高精度移液器（Eppendorf，德國(guó)）；人胃蛋白酶 ELISA試劑盒（Human Pepsin ELISA Kit，YX-160516H，R&D Systems Inc，USA），試劑盒內(nèi)包括所需的微孔酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液、檢測(cè)抗體-HRP、洗滌緩沖液、底物 A、底物 B、終止液封板膜等。

3.實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

①從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出5條微孔酶標(biāo)板；

②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

③樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

④每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60 min；

⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此反復(fù)洗板5次；

⑥每孔加入底物A、B各50 uL，37℃避光孵育15 min；

⑦每孔加入終止液50μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

結(jié) 果

本項(xiàng)研究招募的50名健康受試者痰液中胃蛋白酶含量為（24.22 ±6.941）ng/m l，95%CI為（22.18，26.06）ng/ml。 其中，男性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（22.78 ±1.35）ng/ml，95%CI為（20.00，25.57）ng/ml；女性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（25.67 ±1.39）ng/ml，95%CI為（22.80，28.54）ng/ml。

討 論

咽喉反流性疾病（laryngopharyngeal Refulx Disease，LPRD）是指胃內(nèi)容物（胃酸、胃蛋白酶、胰酶、膽汁酸等物質(zhì)）反流進(jìn)入咽喉部直接接觸咽喉黏膜，并對(duì)其具有侵蝕作用而引起咽喉部各種癥狀的一種疾病?；颊叱３Ｒ匝什慨愇锔小⒙钥人?、頻繁清嗓、發(fā)音疲勞等就診，該病具有診斷價(jià)值的臨床體征主要包括：聲帶彌漫性充血水腫、喉室消失、后聯(lián)合區(qū)域黏膜增生、紅斑或充血、肉芽腫等[9]。研究發(fā)現(xiàn)引起咽喉部黏膜損傷的機(jī)制可能為：胃蛋白酶及胃酸等物質(zhì)反流刺激咽喉部黏膜，可以引起機(jī)體內(nèi)鱗狀上皮蛋白、熱休克蛋白及E-鈣粘蛋白等發(fā)生變化，從而對(duì)黏膜組織造成損傷；胃內(nèi)容物反流可以刺激遠(yuǎn)端食管，引起迷走神經(jīng)反射，從而出現(xiàn)慢性咳嗽和頻繁清嗓等癥狀[10]?？梢娫陴つそM織的損傷過程中，胃蛋白酶起到非常重要的作用，這也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。

由于咽喉反流癥狀不典型、且缺乏臨床特異性，臨床醫(yī)生往往易診斷為“慢性咽喉炎”或“咽異感癥”。有國(guó)外學(xué)者曾報(bào)道在嗓音疾病患者中，50%的pH監(jiān)測(cè)記錄到咽喉反流現(xiàn)象[1]。24 h腔內(nèi)阻抗雙探針pH監(jiān)測(cè)被認(rèn)為是診斷咽喉反流的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是近年來隨著研究的不斷開展及深入，已有越來越多的學(xué)者對(duì)其在咽喉反流診斷中的價(jià)值提出質(zhì)疑，因?yàn)樵摍z查存在諸多不足：①監(jiān)測(cè)探針定位對(duì)操作者技術(shù)水平要求較高，置入位置目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；②置入探針易出現(xiàn)移位、甚至脫落，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果或?qū)е卤O(jiān)測(cè)失?。虎墼摍z查屬于有創(chuàng)操作，部分患者不能耐受，且監(jiān)測(cè)結(jié)果易受到進(jìn)食和活動(dòng)影響。因此尋找一種高效、無創(chuàng)、客觀的診斷方法準(zhǔn)確地診斷咽喉反流性疾病，更符合臨床一線工作者的需要[11]。

胃蛋白酶只有胃壁主細(xì)胞分泌，因此一般認(rèn)為，在上氣道分泌物中檢測(cè)到胃蛋白酶的存在表明有咽喉反流的存在。Knight等[6]對(duì)23例患者的63份痰液標(biāo)本應(yīng)用免疫方法進(jìn)行胃蛋白酶檢測(cè)，并與pH監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，pH監(jiān)測(cè)到咽喉反流后的痰液標(biāo)本14份，其胃蛋白酶含量的中位數(shù)是0.18（0.003～22）mg/mL，pH監(jiān)測(cè)沒有反流的49份痰液標(biāo)本中沒有檢測(cè)到胃蛋白酶。與pH監(jiān)測(cè)結(jié)果對(duì)比，根據(jù)胃蛋白酶檢測(cè)結(jié)果判斷咽喉反流的靈敏度是100%，特異度是89%。作者認(rèn)為，痰液胃蛋白酶檢測(cè)有可能成為診斷咽喉反流的方法，但是由于其需要pH監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)咽喉反流之后取得的痰液標(biāo)本才能檢測(cè)的到胃蛋白酶，認(rèn)為根據(jù)反流情況取痰液進(jìn)行檢測(cè)離臨床實(shí)際應(yīng)用有較大差距。之后大量研究發(fā)現(xiàn)，有咽喉反流癥狀患者的唾液或痰中的胃蛋白酶的含量高于對(duì)照組，而且可以作為判定治療效果的客觀指標(biāo)[12]，但是有研究認(rèn)為唾液中的胃蛋白酶陽性與否與咽喉反流癥狀無相關(guān)性，作為診斷胃食管反流食管外癥狀的方法敏感性較差[13]，也有研究在有咽喉反流癥狀的患者和對(duì)照組的唾液中均未檢測(cè)到胃蛋白酶[14]。

Ocak等研究認(rèn)為增加檢測(cè)痰液標(biāo)本收集次數(shù)有可能提高診斷的敏感性[15]。Fortunato等[16]對(duì)90例阻抗-pH監(jiān)測(cè)證實(shí)的咽喉反流患者和無癥狀的43例對(duì)照組的唾液胃蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)，每例患者進(jìn)行24 h阻抗-pH監(jiān)測(cè)時(shí)取不同時(shí)間段的痰液，共8份（置入pH監(jiān)測(cè)導(dǎo)管前、三餐前和三餐后半小時(shí)以及晨起醒后），而對(duì)照組僅取一次的痰液。85.6%（77/90）的患者組患者至少有一次的唾液胃蛋白酶陽性，而對(duì)照組僅為9.3%（4/43），24 h不同時(shí)間的胃蛋白酶含量差異很大，反流后2 h內(nèi)唾液胃蛋白酶含量為（30.7±13.5） ng/mL，2 h后降為（16.5±39.1）ng/mL，說明唾液胃蛋白酶陽性率與癥狀和pH監(jiān)測(cè)結(jié)果相關(guān)。Na SY等[7]通過對(duì)57例咽喉反流患者晨起空腹?fàn)顟B(tài)下、三餐后1 h唾液中胃蛋白酶含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)晨起空腹?fàn)顟B(tài)下胃蛋白含量最高，認(rèn)為晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的唾液胃蛋白酶檢測(cè)可以作為診斷咽喉反流的方法。由于24 h唾液胃蛋白酶含量值差異較大，唾液胃蛋白酶濃度不能作為判定反流嚴(yán)重程度的準(zhǔn)確指標(biāo)，故取何時(shí)的唾液檢測(cè)胃蛋白酶以作為判定咽喉反流的指標(biāo)值得進(jìn)一步研究。

因正常人可以有一定的咽喉反流，故在正常人群唾液中可以檢測(cè)到微量胃蛋白酶，若口腔唾液中檢測(cè)到較大量的胃蛋白酶，則表明有較嚴(yán)重的咽喉反流的存在，因此唾液胃蛋白酶檢測(cè)有望成為診斷咽喉反流的一種敏感、無創(chuàng)的方法。但是各國(guó)的研究對(duì)唾液中胃蛋白酶的正常值并不統(tǒng)一，國(guó)內(nèi)也缺乏相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Na SY等[7]的研究結(jié)果，取晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的痰液，采用ELISA實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行胃蛋白酶檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)50名健康受試者痰液中胃蛋白酶含量為（24.22 ±6.94）ng/ml，95%CI為（22.18，26.06）ng/ml，這一結(jié)果表明正常成年人晨起空腹?fàn)顟B(tài)下的唾液中存在一定含量的胃蛋白酶。

本研究樣本量有限，建議以后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并開展多中心研究，制定國(guó)人健康人群唾液中胃蛋白酶含量的檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)，以期為臨床診斷咽喉反流提供參考依據(jù)。

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Pepsin measurem ent in saliva of the healthy adults for detection of laryngopharygeal reflux

Li Jinrang1，Tian Shiyu1，Zou Shizhen1，Liu Tao2，Yu Lei2，Wang Wenjun3.

1Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Navy General Hospital，Beijing，100048，China.2Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，The Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang， Hebei，050000，China.3Beijing Qiji Biotechnology Co.Ltd，Beijing 100084，China

Li Jinrang，Email：entljr@sina.com

ObjectiveTomeasure the pepsin level in saliva of the healthy adults in order to find a method to diagnose the laryngopharyngeal reflux disease by measurement of the pepsin level in the saliva of patients.M ethodsFrom Sept.1 2016 to Sept.30，2016 in Department of Otolaryngology Head Neck Surgery，Navy General Hospital，50 healthy adults were random ly recruited as subjects，and the saliva was collected into 1.5ml sterile EP tubes after awaking in themorning，and the tubeswere placed in a refrigerator of-28 ℃ within half an hour，meanwhile the longest freezing timewas less than 2 weeks.The level of pepsin in saliva wasmeasured by human pepsin ELISA kit.ResultsAmong the 50 subjects，the average content of pepsin in saliva was（24.22 ±6.94）ng/m l and the 95%confidence interval was（22.18，26.06）ng/ml.The average content of pepsin in saliva was（22.78 ±1.35）ng/ml and 95%confidence interval was 20.00，25.57）ng/ml inmale group.The average content of pepsin in saliva was（25.67 ±1.39）ng/ml and 95%confidence interval was（22.80，28.54）ng/ml in female group.ConclusionThe pepsin can be detected in the saliva of the healthy adults，the level of the pepsin in the saliva of the patients may be used to the diagnosis of the laryngopharyngeal reflux disease in the future.

Stomach； Pepsin； Laryngopharyngeal； Reference value

10.3877/cma.j.issn.1674-6899.2017.01.00

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)基金資助（2016-2-5111）

100048 北京，海軍總醫(yī)院全軍耳鼻咽喉頭頸外科中心1；050000 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2；100084 北京，北京騏驥生物技術(shù)有限公司3

李進(jìn)讓，Email：entljr@sina.com

2016-12-26）

（本文編輯：王儉）