李龍譚+及少勇+張洪飛+郭漢明

摘要： 為解決傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡樣本上每一點(diǎn)的圖像都受到鄰近點(diǎn)衍射或散射光干擾的問題，研發(fā)了一套基于C# WinForm控制平臺進(jìn)行連續(xù)掃描方式的激光共焦掃描顯微鏡（LCSM）系統(tǒng)，并且成功地對生物細(xì)胞進(jìn)行了掃描成像。針對共焦顯微鏡圖像像質(zhì)不高的問題，提出合理選取探測器針孔直徑，并通過高斯低通濾波、盲解卷積的方法，確保實(shí)現(xiàn)高像質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于上述方法改進(jìn)后的LCSM具有較高圖像質(zhì)量，該方法簡單易行，便于實(shí)施。

關(guān)鍵詞： 顯微鏡； 圖像質(zhì)量； 高斯低通濾波； 盲解卷積

中圖分類號：O 436 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2016.05.012

文章編號： 1005-5630（2016）05-441-04

引 言

光學(xué)顯微鏡是研究物質(zhì)微觀領(lǐng)域的重要手段，尤其是在生物醫(yī)學(xué)[1-3]和材料科學(xué)[4]等領(lǐng)域。普通光學(xué)顯微鏡在成像分辨率和聚焦深度上存在明顯缺陷[5-8]。激光共焦顯微鏡采用與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡完全不同的成像技術(shù)，具有很好的成像質(zhì)量和層析成像能力，可用于觀察活體樣本的深度組織。

在共焦顯微鏡成像中影響圖像分辨率和清晰度的因素主要有噪聲和離焦量，其中噪聲主要包括隨機(jī)噪聲和工頻噪聲。采用斯坦福公司的MODEL SR570前置放大器能夠很好地抑制隨機(jī)噪聲，在數(shù)據(jù)處理時(shí)以均值濾波的方式進(jìn)一步濾除隨機(jī)噪聲。對于交流電產(chǎn)生的工頻噪聲，本文選擇高斯函數(shù)構(gòu)造數(shù)字低通濾波器的方法進(jìn)行濾除。

由于德國PI公司的位移臺在移動(dòng)過程中會使系統(tǒng)機(jī)械結(jié)構(gòu)抖動(dòng)，造成系統(tǒng)離焦，降低圖像質(zhì)量。對圖像的離焦模糊處理方法有盲復(fù)原和非盲復(fù)原兩種方法。非盲復(fù)原包括逆濾波算法和維納濾波算法。逆濾波算法在有些區(qū)域使得傳遞函數(shù)為零或者很小時(shí)，噪聲會在這些區(qū)域被放大，嚴(yán)重影響了圖像的復(fù)原；維納濾波復(fù)原算法效果良好，計(jì)算量低，并且具有很好的抗噪性。盲復(fù)原中的迭代盲解卷積算法簡單直觀，有繼承性，并且能將逆濾波、維納濾波復(fù)原算法應(yīng)用于其迭代過程中。因此，本文在圖像復(fù)原中采用迭代盲解卷積算法。

1 反射式LCSM的工作原理

激光共焦掃描顯微鏡（LCSM）采用共軛焦點(diǎn)技術(shù)，使激光光源、被探測點(diǎn)和探測器處在彼此對應(yīng)的共軛位置[9]。用于激發(fā)熒光的激光束經(jīng)過準(zhǔn)直系統(tǒng)后通過顯微物鏡會聚，入射于待觀察的標(biāo)本內(nèi)部焦點(diǎn)處，激光照射所產(chǎn)生的熒光和少量反射激光一起被物鏡重新收集后，送往分光鏡，其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長直接通過分光鏡，并由收集物鏡聚焦到探測器。由于分光鏡的分光作用，殘余的激光被分光鏡反射，不會到達(dá)探測器。PI位移臺載著待測樣本按照指定掃描路徑運(yùn)動(dòng)，從而完成對樣本的掃描采集，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，顯示出樣本細(xì)胞圖像，整個(gè)系統(tǒng)如圖1所示。在焦平面之前的光在探測器針孔的后端聚焦，大部分光被針孔光闌的邊緣所阻擋，無法到達(dá)探測器，在焦平面之后的光聚焦在探測器針孔之前，大部分光擴(kuò)散在針孔光闌的邊緣，也無法到達(dá)探測器。焦平面上的光都聚焦在探測器針孔上，可以被探測器完全探測。這種能夠抑制焦平面之外雜散光的特性賦予了共焦顯微鏡進(jìn)行深度鑒別和層析成像的本領(lǐng)。

2 改善LCSM像質(zhì)的方法

2.1 選擇針孔大小

LCSM探測針孔大小起著至關(guān)重要的作用，會直接影響系統(tǒng)的軸向分辨率和信噪比。如果針孔過大，會引入雜散光，失去層析能力；如果針孔太小，則會降低到達(dá)探測器的光強(qiáng)，對探測器靈敏度具有較高的要求，同時(shí)影響圖像的信噪比。研究表明[10]，當(dāng)小孔直徑等于艾里斑的直徑時(shí)，探測效率可達(dá)85%以上，且能滿足共焦的要求。物鏡聚焦光斑經(jīng)過無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)放大后，其在針孔處像的直徑為

式中：β為系統(tǒng)的放大倍率；λ為入射光波長；NA為系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。該系統(tǒng)β=40，λ=405 nm，NA=0.95，根據(jù)式（1）計(jì)算得到艾里斑像的大小為20 μm。因此，該系統(tǒng)選用直徑為20 μm的針孔。取樣間隔遵循的原理是衍射極限定理，能夠區(qū)分兩個(gè)艾里斑的取樣間隔為艾里斑半徑。因此，將取樣間隔定位在0.25 μm左右時(shí)，即可滿足高分辨率圖像的要求。

2.2 數(shù)字濾波處理方式

隨機(jī)噪聲具有很寬的頻譜，若采用低通濾波，會造成圖像的細(xì)節(jié)丟失。在避免細(xì)節(jié)丟失的處理中，傳統(tǒng)多幀求平均方法會使掃描時(shí)間成倍增加。為此，本文提出了一種基于均值濾波濾除隨機(jī)噪聲的方法。

對于均值濾波濾除隨機(jī)噪聲的方法，由于數(shù)據(jù)采集卡的采樣頻率較高，在位移間隔內(nèi)可以采集很多點(diǎn)（假設(shè)采集K個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)），將這些值累加后平均或者加權(quán)求平均即為該點(diǎn)的能量值。

由于數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)中使用工業(yè)電，因此數(shù)據(jù)采集的質(zhì)量在很大程度上受到50 Hz工頻的干擾，采集到的圖像數(shù)據(jù)中將會包含工頻干擾，嚴(yán)重影響重構(gòu)圖像的精度。此外，光電倍增管接收到的熒光信號的強(qiáng)度很弱，在進(jìn)行熒光信號采集的過程中，很容易受到該噪聲干擾，會直接影響顯微圖像的清晰度。采用高斯低通濾波器濾除工頻噪聲，其中濾波參數(shù)為σ=0.01，濾波方差為2σ2，濾波半徑為3σ。實(shí)驗(yàn)表明，該濾波器能夠很好地濾除工頻干擾信號并且顯微圖像沒有明顯失真現(xiàn)象。圖2為采集數(shù)據(jù)中的某一行濾波前后的結(jié)果。

2.3 掃描系統(tǒng)的離焦

共聚焦顯微鏡通過安裝在物鏡和檢測器之間的針孔光闌來阻止非焦平面上的雜散光，僅使焦平面上的光通過。在實(shí)驗(yàn)過程中，由于系統(tǒng)機(jī)械結(jié)構(gòu)的抖動(dòng)會造成系統(tǒng)的離焦，圖像的質(zhì)量降低。焦平面上的樣品圖像呈星點(diǎn)云狀，當(dāng)用高分辨率觀察時(shí)，每一個(gè)點(diǎn)實(shí)際就是一系列小的同心環(huán)，如圖3所示；如果稍微偏離焦平面，很多更大的同心環(huán)就會在對應(yīng)的成像位置顯示，如圖4所示。

離焦的程度受物鏡與景物間的距離影響。離焦模糊點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)為

1） 由圖像頻域表達(dá)式G和F^，得到新的估計(jì)H；

2） 由第1）步求出的H經(jīng)傅里葉逆變換得到h，在h的基礎(chǔ)上加上約束條件，得到的結(jié)果經(jīng)過傅里葉變換得到H^，由G和H^得到新的估計(jì)F；

3） 由第2）步求出的F經(jīng)傅里葉逆變換得到f，在f的基礎(chǔ)上加上約束條件，得到的結(jié)果經(jīng)過傅里葉變換得到F^；

4） 由第3）步得到的F^和G算法回到第1）步進(jìn)行迭代，重復(fù)步驟1）～3）；

5） 迭代結(jié)束，f即為盲解卷積后的圖像數(shù)據(jù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用波長為405 nm的半導(dǎo)體激光器，老鼠神經(jīng)細(xì)胞（平均尺寸約為10 μm）作為樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，濾波前的圖像很模糊，經(jīng)過高斯低通濾波后，可以看到淺色部分是離焦造成的模糊，盲去卷積后消除了離焦帶來的模糊，而且部分細(xì)胞可以分清細(xì)胞膜和細(xì)胞核。

4 結(jié) 論

本文研制了基于工作臺連續(xù)運(yùn)動(dòng)的LCSM系統(tǒng)，完成了系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)采集的任務(wù)，并且分析了改善激光共焦掃描顯微鏡系統(tǒng)圖像質(zhì)量的方法。在此基礎(chǔ)上完成了軟件的開發(fā)工作。若納米位移臺造成的機(jī)械抖動(dòng)能夠解決，同時(shí)采用盲去卷積的方法，還能進(jìn)一步提高圖像的質(zhì)量。

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