陳欣雅綜述， 季秋虹審校

外泌體在神經(jīng)退行性病變中的研究進(jìn)展

陳欣雅綜述， 季秋虹審校

外泌體(exosomes)是一種由多種細(xì)胞分泌的直徑為50～90 nm的膜性囊泡。外泌體可以在靶細(xì)胞間激活并運(yùn)輸，從而發(fā)揮其細(xì)胞間信息交流的作用。外泌體內(nèi)不僅含有特定的蛋白和脂質(zhì)，還包含信使RNAs(mRNAs)和microRNAs(miRNAs)。外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形成、再生以及調(diào)節(jié)突觸的功能；在神經(jīng)退行性疾病中，可通過細(xì)胞間傳遞神經(jīng)毒性錯(cuò)誤折疊蛋白而致病。這篇綜述著重強(qiáng)調(diào)了外泌體在神經(jīng)退行性病變及神經(jīng)保護(hù)方面的作用，通過識(shí)別神經(jīng)退行性疾病中外泌體的異常，深入了解其發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)特征性的生物標(biāo)記物對(duì)于疾病的診治有很大幫助。

1 外泌體的生物起源和內(nèi)容

外泌體包含各種蛋白、脂質(zhì)和核酸。通過對(duì)外泌體起源和轉(zhuǎn)運(yùn)的認(rèn)識(shí)，有助于我們理解細(xì)胞如何利用外泌體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間交流及改變外周環(huán)境。外泌體的形成起源于漿膜上網(wǎng)格蛋白微區(qū)的內(nèi)吞作用，轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物(ESCRT)促進(jìn)由內(nèi)吞作用產(chǎn)生的囊泡形成裝載有“貨物”的早期核內(nèi)體，早期核內(nèi)體逐漸蓄積和成熟形成晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體內(nèi)產(chǎn)生很多小囊泡(ILVs)，進(jìn)一步形成多囊泡體(MVBs)[1，2]。MVBs與質(zhì)膜融合，導(dǎo)致小囊泡釋放到細(xì)胞外空間從而發(fā)揮作用。Trajkovic等人[3]證明，在少突細(xì)胞中，ILVs的釋放依賴于ESCRT，MVBs內(nèi)鞘磷脂神經(jīng)酰胺的分布可調(diào)節(jié)胞外ILVs的釋放，從而調(diào)節(jié)外泌體的釋放。一些研究表明，外泌體的釋放依賴于Rab27和Rab35，且被神經(jīng)鞘磷脂酶抑制劑阻斷[3,4]。另一個(gè)研究指出，Ca2+及離子載體A23187可誘導(dǎo)外泌體釋放[5]。

外泌體的組成包括膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)蛋白(GTP酶、flotillin、annexins)、四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、熱休克蛋白(HSP70，HSP90)、多囊泡泡體內(nèi)產(chǎn)生相關(guān)蛋白(Alix,TSG101)，脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶。來源不同的外泌體含有不同的蛋白，這些蛋白均可作為陽性“標(biāo)記物”。最常見的標(biāo)記物為TSG101,Alix,flotillin和 Rab5b，免疫印跡或者ELISA法均可檢測(cè)，證明外泌體的存在。除了膜相關(guān)蛋白以外，質(zhì)譜分析可鑒別與外泌體相關(guān)的4400多種蛋白，這些蛋白參與細(xì)胞間的相互聯(lián)系[6]。

外泌體的脂質(zhì)含量十分豐富，不同細(xì)胞來源的外泌體其脂質(zhì)組成的成份各不相同，與外泌體的形成密切相關(guān)，包括磷脂酰膽堿、磷脂酰、乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)酰胺、膽固醇和鞘磷脂。脂質(zhì)成份如鞘磷脂和GM3，決定了外泌體不同的生物學(xué)功能，同時(shí)也決定了它們的傳送效率[7]。而外泌體膜上磷脂酰絲氨酸水平的高低會(huì)影響其信息交流的功能。

除了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，外泌體還包含有核酸(包括miRNA，mRNA)和其他非編碼RNA。許多研究報(bào)道，外泌體的RNA不同于親代細(xì)胞的RNA[8]。也有一些報(bào)道，來源于癌癥細(xì)胞的外泌體包含有與親代細(xì)胞相同的miRNA，因此可以用作腫瘤標(biāo)記物[9]。通過電鏡鑒定外泌體尋找疾病的生物標(biāo)記物，費(fèi)時(shí)且昂貴，通過miRNA來證明外泌體的存在不失為一個(gè)更好的方法。由外泌體攜帶的mRNAs可以在受體細(xì)胞中翻譯，同時(shí)miRNAs和ncRNAs可以調(diào)控基因的表達(dá)。外泌體中也包含DNA，但這些DNA的功能還未被證實(shí)。

總之，外泌體可由各種細(xì)胞分泌，并且包含多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。因此外泌體可以看成是運(yùn)輸者、細(xì)胞間交流的橋梁，在起源細(xì)胞與其他細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)傳遞。

2 神經(jīng)元之間通過外泌體的交流

外泌體通過傳遞活化的分子與鄰近的細(xì)胞相互聯(lián)系，因此細(xì)胞間的信息交流是外泌體的主要功能。Skog等人[10]研究了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與軸突之間蛋白質(zhì)和miRNAs的運(yùn)輸。為了應(yīng)答谷氨酸能突觸的活化，海馬神經(jīng)元和培養(yǎng)的皮質(zhì)細(xì)胞向胞外釋放外泌體。特異的髓磷脂脂質(zhì)(半乳糖腦苷脂，硫苷脂和膽固醇)通過少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放進(jìn)入外泌體，是髓磷脂鞘和神經(jīng)傳導(dǎo)的本質(zhì)特征。

在病理環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞可以被激活，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌外泌體發(fā)揮著抗原提呈細(xì)胞的作用。ATP的刺激和鞘磷脂酶活化后，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的漿膜可以釋放外泌體，這些外泌體中含有促炎癥因子IL-β。氧化反應(yīng)和熱應(yīng)激后，培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞也可以釋放外泌體，而這些外泌體中含有熱休克蛋白70和突觸蛋白-1。Guescini等[11]報(bào)道，星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體含有線粒體DNA，而來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞和惡性膠質(zhì)瘤的腦腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體包含有免疫抑制劑和致癌因子。因此，外泌體通過轉(zhuǎn)移不同來源的分子發(fā)揮其細(xì)胞間信息交流的作用。

3 神經(jīng)退行性病變中的外泌體

神經(jīng)細(xì)胞的死亡是神經(jīng)退行性變的一個(gè)主要原因，也是許多疾病如阿爾茨海默癥(AD)、亨廷頓舞蹈癥(HD)、帕金森疾病(PD)、尼曼克氏癥、額顳癡呆、肌萎縮側(cè)索硬化癥等神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志。以上疾病都涉及神經(jīng)系統(tǒng)中受累區(qū)域蛋白的聚集和內(nèi)含物的形成。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確分選和降解對(duì)于維持神經(jīng)元的健康狀態(tài)十分重要。外泌體與神經(jīng)退行性疾病中突變的錯(cuò)誤折疊蛋白的傳播有關(guān)，這些“毒性”蛋白可以作為寡聚體形成模板。神經(jīng)元通過胞內(nèi)體途徑對(duì)這些蛋白進(jìn)行加工并嘗試去除這些聚集的蛋白，最終這些蛋白被降解進(jìn)入溶酶體或者合并入MVBs，后者最終以外泌體的形式釋放入胞外環(huán)境中。

1970年P(guān)aula-Barbosa等人[12]首次發(fā)現(xiàn)AD患者前腦皮質(zhì)神經(jīng)元中MVBs的數(shù)量明顯增加。淀粉狀蛋白β42(Aβ42)作為AD特征性老年斑的主要成分 ，聚集在MVBs中。AD患者體內(nèi)的外泌體將不恰當(dāng)分選及聚集的淀粉狀蛋白-β傳遞到其他組織。當(dāng)清除通路被抑制時(shí)，外泌體在毒性Aβ的降解和毒性肽段的聚集方面均有一定作用。

1997年在亨廷頓疾病中首次發(fā)現(xiàn)了MVBs，突變的亨廷頓蛋白聚集在MVBs中。除MVBs外，其他膜結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂筏、晚期內(nèi)含體也發(fā)現(xiàn)了亨廷頓蛋白[13，14]。亨廷頓相關(guān)蛋白(HAP-1)與ESCRT-O相互作用，其過量表達(dá)與通過MVBs與溶酶體生物EGF受體運(yùn)輸損傷相關(guān)。

PD是僅次于AD的常見神經(jīng)退行性疾病，以路易小體黑質(zhì)內(nèi)選擇性的多巴胺神經(jīng)元變性為特征，而路易小體主要由α-突觸核蛋白(α-syn)和泛素化蛋白組成。90%的PD患者散發(fā)，家族性的病例與α-syn和LRRK2等基因有關(guān)。但目前為止該疾病確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。在PD中外泌體傳遞α-syn的毒性形式并釋放α-syn沉積物[1,15，16]。神經(jīng)元間傳遞的α-syn可以在受體細(xì)胞中沉積。星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)吞作用可清除α-syn的沉積[17，18]。但是，過量攝取α-syn可產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)包含物并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。LRRK2在外泌體分泌和MVBs與漿膜融合的過程中發(fā)揮作用。2008年Shin等[20]證明了LRRK2與內(nèi)吞載體的運(yùn)輸調(diào)節(jié)者Rab5b之間相互作用。阿爾茨海默病的致病蛋白tau蛋白可以加速外泌體介導(dǎo)的α-syn毒素從損傷的神經(jīng)元中釋放。探索LRRK2，tau與外泌體之間的相互關(guān)系為α-syn的蔓延和PD的進(jìn)展提供了重要的線索。

朊蛋白病是由朊病毒蛋白PrPsc異常引起的一種毒性的羊瘙癢病，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡并引起腦組織內(nèi)海綿狀空泡。朊病毒蛋白PrPc和PrPsc 均與外泌體相關(guān)，且含外泌體的PrPsc 在動(dòng)物和細(xì)胞中都具有傳染性。除了細(xì)胞培養(yǎng)物可以隔離外泌體載體，原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和腦脊液作為外泌體的來源可以檢測(cè)到阮病毒顆粒[22]。阮病毒疾病中MVBs發(fā)生異常并且增加，為外泌體促進(jìn)朊病毒疾病的進(jìn)展提供了依據(jù)。

4 外泌體在神經(jīng)保護(hù)方面的作用

許多研究均顯示了外泌體在神經(jīng)元保護(hù)、神經(jīng)元再生、神經(jīng)元形成、突觸可塑性方面的作用，并且闡明了外泌體可由神經(jīng)元，小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等釋放。在小鼠大腦早期神經(jīng)形成的過程中，外泌體即被釋放入神經(jīng)管內(nèi)的腦室液中[23]。由外泌體介導(dǎo)的空間和時(shí)間梯度在神經(jīng)元的形成過程中很重要。

5 外泌體在神經(jīng)退行性病變治療方面的作用

許多藥物不能通過血腦屏障，這是現(xiàn)代神經(jīng)藥理學(xué)所面臨的一個(gè)大問題。在這一方面外泌體很有優(yōu)勢(shì)，它可以通過血腦屏障。最近的報(bào)道也證明了外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有抗神經(jīng)炎癥的作用。比如，包裹外泌體的姜黃可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥，同時(shí)抑制髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)[24]。關(guān)于外泌體在治療方面的研究也越來越成熟，相信在不久的將來應(yīng)用于臨床。

6 總 結(jié)

外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中參與許多重要的過程，正常環(huán)境下可以在神經(jīng)元細(xì)胞間進(jìn)行信息交流，外泌體在神經(jīng)退行性疾病中又與錯(cuò)誤折疊的蛋白傳播有關(guān)，外泌體在神經(jīng)元保護(hù)、神經(jīng)再生、神經(jīng)元形成、突觸可塑性方面扮演者重要的角色。因此，深入了解外泌體的生理功能和在神經(jīng)退行性疾病中的致病機(jī)制，對(duì)研究神經(jīng)退行性疾病的診療方法有重大意義和臨床應(yīng)用前景。

[1] Denzer K,Kleijmeer MJ,Heijnen HF,et al.Exosome: from internal vesicle of the multivesicular body to intercellular signaling device[J].J Cell Sci,2000,113:3365-3374.

[2] Mathivanan S,Ji H,Simpson RJ.Exosomes:extracellular organelles important in intercellular communication[J].J Proteomics,2010,73:1907-1920.

[3]Trajkovic K,Hsu C,Chiantia S,et al.Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes[J].Science,2008,319:1244-1247.

[4]Ostrowski M,Carmo NB,Krumeich S,et al.Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway[J].Nat Cell Biol,2010,12:19-30.

[5]Allan D,Thomas P,Limbrick AR.The isolation and characterization of 60 nm vesicles (nanovesicles) produced during ionophore A23187-induced budding of human erythrocytes[J].Biochem J,1980,188:881-887.

[6]Mathivanan S,Simpson RJ.ExoCarta:a compendium of exosomal proteins and RNA[J].Proteomics,2009,9:4997-5000.

[7]Parolini I,Federici C,Raggi C,et al.Microenvironmental pH is a key factor for exosome traffic in tumor cells[J].J Biol Chem,2009,284:34211-34222.

[8]Mittelbrunn M,Gutierrez-Vazquez C,Villarroya-Beltri C,et al.Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigenpresenting cells[J].Nat Commun,2011,2:282.

[9]Rabinowits G,Gercel-Taylor C,Day JM,et al.Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2009,10:42-46.

[10]Skog J,Wurdinger T,van Rijn S,et al.Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers[J].Nat Cell Biol,2008,10:1470-1476.

[11]Van der Vos KE,Balaj L,Skog J,et al.Brain tumor microvesicles: insights into intercellular communication in the nervous system[J].Cell Mol Neurobiol,2011,31:949-959.

[12]Paula-Barbosa MM,Mota CR,Faria R,et al.Multivesicular bodies in cortical dendrites of two patients with Alzheimer’s disease[J].J Neurol Sci,1978,36:259-264.

[13]Atwal RS,Truant R.A stress sensitive ER membrane-association domain in Huntingtin protein defines a potential role for Huntingtin in the regulation of autophagy[J].Autophagy,2008,4:91-93.

[14]Kegel KB,Kim M,Sapp E,et al.Huntingtin expression stimulates endosomal-lysosomal activity,endosome tubulation,and autophagy[J].J Neurosci,2000,20:7268-7278.

[15]Bellingham SA,Guo BB,Coleman BM,et al.Exosomes: vehicles for the transfer of toxicproteins associated with neurodegenerative diseases[J].Front Physiol,2012,3:124.

[16]Emmanouilidou E,Melachroinou K,Roumeliotis T,et al.Cell-produced alpha-synuclein is secreted in a calcium-dependent manner by exosomes and impacts neuronal survival[J].J Neurosci,2010,30:6838-6851.

[17]Schneider A,Simons M.Exosomes:vesicular carriers for intercellular communication in neurodegenerative disorders[J].Cell Tissue Res,2013,352:33-47.

[18]Lee HJ,Suk JE,Bae EJ,et al.Assembly-dependent endocytosis and clearance of extracellular alpha-synuclein[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,40:1835-1849.

[19]Lee HJ,Suk JE,Patrick C,et al.Direct transfer of alpha-synuclein from neuron to astroglia causes inflammatory responses in synucleinopathies[J].J Biol Chem,2010,285:9262-9272.

[20]Shin N,Jeong H,Kwon J,et al.LRRK2 regulates synaptic vesicle endocytosis[J].Exp Cell Res,2008,314:2055-2065.

[21]Giasson BI,Forman MS,Higuchi M,et al.Initiation and synergistic fibrillization of tau and alpha-synuclein[J].Science,2003,300:636-640.

[22]Vella LJ,Greenwood DL,Cappai R,et al.Enrichment of prion protein in exosomes derived from ovine cerebral spinal fluid[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,124:385-393.

[23]Marzesco AM,Janich P,Wilsch-Brauninger M,et al.Release of extracellular membrane particles carrying the stem cell marker prominin-1 (CD133) from neural progenitors and other epithelial cells[J].J Cell Sci,2005,118:2849-2858.

[24]Zhuang X,Xiang X,Grizzle W,et al.Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain[J].Mol Ther,2011,19(10):1769-1779.

1003-2754(2017)02-0191-02

R741

2016-10-29；

2017-01-30

國(guó)家自然科學(xué)基金(81201016，81272027，81071483)；南通市民生示范推廣項(xiàng)目(MS32015026)；南通大學(xué)研究生創(chuàng)新計(jì)劃(YKC16099)

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

季秋虹，E-mail：jiqiuhong@sina.com