王彥，滕花景，孫中生

揭秘生物晝夜節(jié)律的分子機(jī)制
—— 2017諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)解讀

王彥，滕花景，孫中生

2017 年 10 月 2 日，諾貝爾獎(jiǎng)評選委員會(huì)在瑞典首都斯德哥爾摩宣布，本屆諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)由美國的三位生物學(xué)家分享：布蘭迪斯大學(xué)遺傳學(xué)家杰弗里·霍爾（Jeffrey C. Hall）教授和同一大學(xué)的分子生物學(xué)家邁克爾·羅斯巴什（Michael M. Rosbash）教授，以及洛克菲勒大學(xué)的邁克爾·楊（Michael W. Young）教授，以表彰他們在揭示生物晝夜節(jié)律的分子機(jī)制方面做出的重大貢獻(xiàn)。

霍爾 1945 年出生于美國紐約，1971 年在西雅圖華盛頓大學(xué)獲哲學(xué)博士學(xué)位，1971 - 1973 年在加州理工學(xué)院西蒙·本哲（Seymour Benzer）教授實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究。1974 年就職于布蘭迪斯大學(xué)。2002 年后到美國緬因大學(xué)任職直至 2012 年退休?；魻柦淌谥铝τ诠壡笈夹袨楹蜕锕?jié)律的神經(jīng)生物學(xué)研究。

羅斯巴什 1944 年出生于美國堪薩斯城。他師從謝耳頓·彭曼（Sheldon Penman）教授，于 1970 年獲得麻省理工大學(xué)生物物理學(xué)博士學(xué)位。而后在英國愛丁堡大學(xué)從事博士后研究。從 1974 年至今就職于布蘭迪斯大學(xué)。羅斯巴什早期的工作主要集中在 mRNA 的代謝和加工，而后主要從事生物節(jié)律的研究。

楊 1949 年出生于美國邁阿密。1975 年，在德克薩斯大學(xué)獲得遺傳學(xué)博士學(xué)位。1975 - 1977 年在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院大衛(wèi)·霍格內(nèi)斯（Dave Hogness）實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究，主要研究領(lǐng)域?yàn)?DNA 重組。從 1978 年開始在洛克菲勒大學(xué)任職，致力于果蠅覺醒和睡眠周期的遺傳學(xué)研究。

1 晝夜節(jié)律分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和證明是生命科學(xué)的一個(gè)重要進(jìn)展

在自然界中，從單細(xì)胞的藍(lán)藻到高等動(dòng)植物均存在著一種以 24 h 左右為周期的、按照一定規(guī)律運(yùn)行的生命活動(dòng)，稱之為晝夜節(jié)律。作為生命活動(dòng)的基本特征之一，晝夜節(jié)律是由內(nèi)源性“生物鐘”驅(qū)動(dòng)的，是生物在長期進(jìn)化過程中形成的與自然環(huán)境變化相適應(yīng)的內(nèi)源性節(jié)律[1-2]。該生物鐘既可以自激振蕩，又可以接受環(huán)境周期變化的信號來調(diào)控自激振蕩，使機(jī)體生命活動(dòng)的晝夜節(jié)律與環(huán)境同步。生物鐘可以精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)機(jī)體的生理機(jī)能，包括激素水平、睡眠需求、體溫和新陳代謝等，保證機(jī)體的正常發(fā)育和生長。大量證據(jù)表明，當(dāng)一個(gè)人的生活方式與內(nèi)在生物鐘節(jié)律長期不相符時(shí)，患多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，如肥胖、糖尿病、高血壓、高血脂和惡性腫瘤[3-8]。

對多種不同生命有機(jī)體的生物節(jié)律研究始于 20 世紀(jì)中期。如德國生物學(xué)家歐文·本林（Erwin Bunning）發(fā)現(xiàn)了植物葉閉合活動(dòng)的節(jié)律行為[9-11]；德國醫(yī)生和生物學(xué)家尤金·阿紹夫（Jürgen Aschoff）在大鼠、小鼠、鳥類、恒河猴等多個(gè)物種和人類中觀察到了不同外環(huán)境刺激對生物節(jié)律行為的影響，并提出“倒班”制度對身心健康的可能危害[12-16]；美國生物學(xué)家科林·皮登覺（Colin Pittendrigh）研究了果蠅的生物節(jié)律行為[17]。本林、阿紹夫和皮登覺等的研究對生物節(jié)律存在的普遍性、基本特征和規(guī)律有了較為全面的描述和深入的了解，奠定了現(xiàn)代生物節(jié)律研究的基礎(chǔ)，因此他們?nèi)吮蛔鸱Q為“生物節(jié)律之父”。但他們當(dāng)時(shí)的研究還無法從細(xì)胞和分子的水平闡明生物鐘的組成元件和運(yùn)行機(jī)制。

1971 年，本哲首先發(fā)現(xiàn)影響果蠅生物鐘的基因突變，開啟了生物鐘的基因研究[18]。他們運(yùn)用遺傳學(xué)方法建立了果蠅的突變株，并觀察這些果蠅的羽化節(jié)律。于 1971 年篩選到了三個(gè)突變果蠅品系，在節(jié)律周期上分別出現(xiàn)三個(gè)不同方向的改變（表型分別為“無節(jié)律”、“節(jié)律變長”和“節(jié)律變短”），并與同一個(gè)基因相關(guān)。他們將這一基因命名為“周期基因”（period，per），并在果蠅染色體中確定了per基因的位置，首次證明果蠅生物鐘行為是受基因調(diào)控的。

1984 年，楊和羅斯巴什這兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)分別克隆了果蠅per的 DNA 序列[19-22]，其長度約為 4.5 kb[20,23]。將編碼per基因的 DNA 序列導(dǎo)入per突變果蠅，即可恢復(fù)其晝夜節(jié)律[20]。他們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，per基因的 mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)與晝夜同步的節(jié)律變化[24]，早晨水平較低，夜晚水平升高。per編碼的蛋白 PER 位于細(xì)胞核中[25]，其水平也呈現(xiàn)類似的晝夜節(jié)律變化[26-27]。PER 蛋白受磷酸化調(diào)節(jié)，同時(shí)也受per表達(dá)水平的調(diào)節(jié)[28-29]。在生物鐘變短的果蠅突變株per中，per的 mRNA 和 PER 蛋白水平的晝夜節(jié)律周期均顯著變短[24,29]，提示per的基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA 與翻譯的 PER 蛋白存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)。此研究為揭示“轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路（transcription-translation feedback loop）”理論奠定了基礎(chǔ)[24]。此外，羅斯巴什和楊團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)permRNA 與蛋白的晝夜節(jié)律之間有一定的間隔，也就是“相位”不同，PER 蛋白和permRNA 這種節(jié)律變化在“持續(xù)黑暗條件（constant darkness）”下依然存在[29]。

繼per基因之后，其他生物鐘基因也相繼被克隆。1994年，楊實(shí)驗(yàn)室鑒定并克隆了果蠅的timeless基因（tim），還發(fā)現(xiàn)tim可以影響 PER 蛋白出入細(xì)胞核[30-32]。1998 年，羅斯巴什實(shí)驗(yàn)室在果蠅中發(fā)現(xiàn)了clock基因[33]；霍爾實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了 chryptochrome（cry）基因參與果蠅生物鐘[34]；霍爾和羅斯巴什團(tuán)隊(duì)合作發(fā)現(xiàn)了 cycle 基因（cyc）[35]等。

現(xiàn)在我們對以 24 h 為周期的果蠅生物鐘的分子構(gòu)成和運(yùn)行機(jī)制已有了基本了解：在細(xì)胞核內(nèi)，CLK 和 CYC蛋白（正向調(diào)節(jié)因子）形成異二聚體，通過結(jié)合per、tim和cry（負(fù)向調(diào)節(jié)因子）啟動(dòng)子區(qū)域的 E-box 元件，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄；在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，PER、TIM 和 CRY 蛋白形成異二聚體后轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，通過與正向調(diào)節(jié)因子結(jié)合而抑制負(fù)向調(diào)節(jié)因子本身的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路[36]。

晝夜節(jié)律基因及其運(yùn)行調(diào)控機(jī)制也同樣存在于哺乳動(dòng)物中。1994 年，美國西北大學(xué)的約瑟夫·高橋（Joseph Takahashi）發(fā)現(xiàn)了小鼠的生物鐘clock基因（clk）[37]，并在 1997 年克隆了clk的 DNA 序列[38-39]。同年，美國貝勒醫(yī)學(xué)院和日本東京大學(xué)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在小鼠和人類基因組中分別發(fā)現(xiàn)和克隆了per基因[40-41]。

此外，美國約翰·霍普金斯大學(xué)的科特·瑞科特（Curt P. Richter）教授也對大鼠的生物鐘行為做了多方面的深入研究，他們提出下丘腦的前端可能是哺乳動(dòng)物生物鐘的振蕩器所在位置[42-43]。美國的伯克利加州大學(xué)的朱可（Irving Zucker）[44]和芝加哥大學(xué)的莫爾（Robert Moore）[45]發(fā)現(xiàn)了下丘腦前端的視交叉上核是啟動(dòng)大鼠生物鐘的關(guān)鍵元件。日本東京大學(xué)的井上進(jìn)一（Shin-Ichi Inouye）和川村宏（Hiroshi Kawamura）發(fā)現(xiàn)視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）神經(jīng)細(xì)胞可能起調(diào)控和協(xié)調(diào)周圍組織的生物鐘保持同步運(yùn)行的作用，從而被稱為“主鐘”（master clock）[46]。

2 我國科學(xué)家在該領(lǐng)域的貢獻(xiàn)

我國科學(xué)家也為揭示生物鐘運(yùn)行的分子機(jī)制做出了重要貢獻(xiàn)。他們中很多人在國外留學(xué)或工作期間參與了這一領(lǐng)域的重要工作。多名中國留學(xué)生參與了羅斯巴什實(shí)驗(yàn)室對果蠅生物鐘的研究，如：俞強(qiáng)發(fā)現(xiàn)了果蠅 PER 蛋白缺失某一特定區(qū)段會(huì)影響其求偶時(shí)翅膀有節(jié)律地歌唱[47-48]；黃佐石發(fā)現(xiàn) PER 可通過其 PAS 功能域與含有 bHLH-PAS 功能域的轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物節(jié)律基因的轉(zhuǎn)錄[49]；劉欣發(fā)現(xiàn)了per基因的時(shí)空表達(dá)和 PER 蛋白的亞細(xì)胞定位[25,50]；曾紅葵闡明了 PER-TIM 復(fù)合體在果蠅生物鐘的調(diào)控作用[51]。

在哺乳類動(dòng)物生物節(jié)律的研究中也有我國科學(xué)家的貢獻(xiàn)。1997 年，在美國貝勒醫(yī)學(xué)院從事博士后研究的孫中生等在克隆小鼠乳腺癌基因的過程中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因與果蠅的生物鐘基因per呈現(xiàn)高度的局部序列相似性，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)具有 24 小時(shí)的節(jié)律，且能隨光周期的改變而變化。他們依據(jù)我國古老的授時(shí)裝置——“日晷”，特地將該基因命名為 RIGUI[41]，隨后該基因被正式命名為per1。此外，他們還在小鼠和人中發(fā)現(xiàn)了per基因的第二個(gè)同源基因per2。Per2 基因在晝夜節(jié)律的控制中樞——視交叉上核中的表達(dá)相對于per1 推遲 4 ～ 6 h，但與per1 一樣具有晝夜節(jié)律基因的所有特性。為了確定per1、per2 基因在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中的作用，他們通過基因敲除成功獲得了per1-/-、per2-/-、per1/2 雙敲除三種小鼠品系。在持續(xù)黑暗條件下，per1/2 雙敲除小鼠完全丟失活動(dòng)節(jié)律性。但在同樣條件下，一些per2-/-小鼠的節(jié)律周期變短或丟失，而per1-/-小鼠節(jié)律周期則變長[52-53]。在成功克隆小鼠的生物鐘基因以后，他們首次測定了人類外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中per1、per2、per3 和DEC1 節(jié)律基因的表達(dá)模式，揭示了哺乳動(dòng)物免疫生物鐘的存在[54]，發(fā)現(xiàn)生物鐘基因per2 參與調(diào)控免疫功能和內(nèi)源的免疫應(yīng)答[55]。此外，他們的研究還證明了機(jī)體內(nèi)生物鐘系統(tǒng)是疼痛節(jié)律性產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床痛癥的時(shí)間生物學(xué)治療奠定了理論基礎(chǔ)[56]。但是轉(zhuǎn)錄組水平的研究發(fā)現(xiàn)僅有不到 20% 的基因的節(jié)律表達(dá)受轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控。最近，他們與中南大學(xué)李家大教授的團(tuán)隊(duì)合作，通過整合近 5000 個(gè)哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組和調(diào)控組數(shù)據(jù)，對 37 個(gè)人或小鼠的組織/細(xì)胞系、三種臨床疾病的基因表達(dá)模式和調(diào)控因素進(jìn)行了系統(tǒng)分析，開發(fā)了一個(gè)方便用戶挖掘節(jié)律相關(guān)信息的平臺(tái)—— CirGRD（http：// cirgrdb.biols.ac.cn/），為進(jìn)一步揭示生物鐘基因調(diào)節(jié)各種生理過程及疾病發(fā)生的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[57]。

2001 年，當(dāng)時(shí)在美國舊金山加州大學(xué)工作的傅穎慧等通過對一家族性睡眠相位提前綜合征患者的家系進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)家系中的一個(gè)含有hper2 編碼的特定位點(diǎn)變異（對應(yīng)于其蛋白質(zhì)序列的 662 位絲氨酸）的成員，相位比一般人提前 4 小時(shí)，每天早上 4 點(diǎn)半醒，晚上 7 點(diǎn)半睡；凡是這個(gè)位點(diǎn)沒有變異的成員，睡眠相位就正常[58]。2005年，當(dāng)時(shí)在傅穎慧實(shí)驗(yàn)室工作，現(xiàn)執(zhí)教于蘇州大學(xué)的徐瓔教授發(fā)現(xiàn) CKIδ 基因突變也能導(dǎo)致人和小鼠相位提前[59]。現(xiàn)在北京生命科學(xué)研究所，當(dāng)時(shí)在美國加州大學(xué)圣地亞哥分校從事博士后研究的張二荃首次運(yùn)用 RNAi 技術(shù)篩選生物鐘基因，找到了多個(gè)影響人類生物鐘的基因[60]。中山大學(xué)的郭金虎教授于 2009 年在美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的劉一教授實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究期間，發(fā)現(xiàn)了一條新的轉(zhuǎn)錄后負(fù)反饋回路能通過影響 mRNA 的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)脈孢菌的晝夜節(jié)律[61]。

3 結(jié)語

隨著生物鐘基因的克隆及生物鐘核心分子調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，生物節(jié)律的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到生物鐘基因是如何在分子水平上調(diào)節(jié)各種生理過程及疾病的發(fā)生。生物鐘調(diào)控環(huán)路不僅僅只影響其內(nèi)部各節(jié)律基因的表達(dá)呈節(jié)律性變化，而且通過正向調(diào)控和負(fù)相調(diào)控機(jī)制的作用，進(jìn)一步影響下游基因也呈現(xiàn)這種節(jié)律性的表達(dá)變化。轉(zhuǎn)錄組水平的證據(jù)表明，在各種不同的組織中，有 10% ～ 15% 的基因在 RNA 水平的表達(dá)具有節(jié)律性。這些下游基因在更多生理過程中承擔(dān)著重要的調(diào)節(jié)作用，所以也使得哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種生理行為的變化呈現(xiàn)節(jié)律[62-66]。這些節(jié)律基因的表達(dá)是受多層次不同水平調(diào)控的，除了受經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控外，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控如組蛋白修飾、染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)等在其節(jié)律表達(dá)中亦發(fā)揮了重要的作用。因此，在細(xì)胞-組織-器官-生物體的整體水平上解析生物鐘的元件并揭示其調(diào)控機(jī)制，不僅對我們了解生命和生命活動(dòng)具有重大的理論意義，而且將為治療由于晝夜節(jié)律失常所引發(fā)的人類疾病提供有價(jià)值的線索[67-69]。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.06.009

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孫中生，Email：sunzs@biols.ac.cn

2017-10-23