韓運(yùn)寧，亓建洪

體外組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨的研究進(jìn)展

韓運(yùn)寧，亓建洪

同種異體軟骨移植是成功治療大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損的一種選擇。大量研究報(bào)道，異體骨軟骨移植后軟骨移植物的存活率較高，10 年存活率在 71% ～ 85% 之間，15 年存活率高達(dá) 74%，20 年存活率可以達(dá)到 66%[1]。相對于關(guān)節(jié)置換手術(shù)，同種異體軟骨移植術(shù)后的患者恢復(fù)快、效果好。運(yùn)動(dòng)人群中 88% 的病人可重新運(yùn)動(dòng)，其中 79% 的病人可以恢復(fù)到受傷前的運(yùn)動(dòng)水平[2]?？傮w來說，同種異體骨軟骨移植治療已經(jīng)取得很好的效果。然而，在保存期間軟骨細(xì)胞生物活性的降低限制了同種異體軟骨移植的應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)保存 7 d 內(nèi)的軟骨細(xì)胞活性最適合應(yīng)用于臨床，超過這個(gè)時(shí)間軟骨細(xì)胞活性明顯降低[3-4]，當(dāng)移植物細(xì)胞存活率低于70% 時(shí)，手術(shù)效果很不理想[5]。而異體軟骨在移植到患者之前需要經(jīng)歷移植物的轉(zhuǎn)運(yùn)、病原檢查等必要步驟，至少需要 1 ～ 2 周的時(shí)間。因此延長體外軟骨的保存時(shí)間，并維持其原有的生物學(xué)、生物力學(xué)特性，對于擴(kuò)大軟骨移植臨床應(yīng)用與提高移植效果尤為重要，也是同種異體軟骨移植手術(shù)成功與否的關(guān)鍵。目前體外軟骨保存的方法有冷凍保存法、組織培養(yǎng)法等。有實(shí)驗(yàn)研究顯示組織培養(yǎng)法的保存效果要優(yōu)于冷凍保存法[6-8]，且保存時(shí)間最長可達(dá) 60 d[9]。因此如何進(jìn)一步地提高組織培養(yǎng)法保存軟骨的效果成為研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，本文主要從軟骨保存液的成分和保存環(huán)境兩個(gè)方面綜述，以尋求更理想的保存方法。

1 保存環(huán)境

1.1 保存溫度

目前組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨常用的保存溫度為 4 ℃、37 ℃ 和 25 ℃。4 ℃ 條件下可以減緩軟骨細(xì)胞的代謝，維持原有的細(xì)胞外基質(zhì)成分。LaPrade 等[10]在 4 ℃ 條件下保存軟骨 28 d，細(xì)胞存活率可以達(dá)到 70% 的閾值。Qi 等[11]采用每兩天換一次培養(yǎng)液的方法保存軟骨，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4 ℃ 條件下的保存效果優(yōu)于 37 ℃ 條件下的保存。有研究人員模擬軟骨細(xì)胞生存的生理溫度，即在 37 ℃ 條件下保存軟骨。Garrity 等[12]用一種無血清的保存液在 37 ℃ 下保存狗的膝關(guān)節(jié)軟骨 56 d，軟骨細(xì)胞存活率可以達(dá)到 70%。相比 4 ℃ 下保存，軟骨細(xì)胞存活率有了明顯的提高。但是黏多糖、膠原蛋白含量和生物力學(xué)性能與 4 ℃ 下保存效果相比沒有明顯差異。Pallante 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃ 保存軟骨 28 d 后檢測軟骨細(xì)胞存活率，軟骨表面的細(xì)胞存活率可達(dá) 80%，淺層區(qū)域?yàn)?65%，中層為 70%。而該實(shí)驗(yàn)中 4 ℃保存條件下的細(xì)胞存活率分別只有 45%、20%、35%。Cook等[9]在室溫下，即在 25 ℃ 下用 MOPS 保存液保存羊關(guān)節(jié)軟骨獲得了理想的結(jié)果。由于保存液的成分和實(shí)驗(yàn)條件的不同，4 ℃、37 ℃ 和 25 ℃ 下的保存效果尚存在爭議，需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件選擇合適的保存溫度。

1.2 換液頻率

組織培養(yǎng)法保存軟骨與培養(yǎng)細(xì)胞類似，需要定期更換培養(yǎng)液。保存軟骨時(shí)多采用 2 d 更換一次培養(yǎng)液的方式來為體外軟骨提供足夠的營養(yǎng)，維持其基本代謝[11]。但換液頻率對保存效果的影響尚沒有相關(guān)的研究。

1.3 應(yīng)力環(huán)境

正常的軟骨在體內(nèi)會(huì)受到周期性應(yīng)力的作用，有利于軟骨細(xì)胞吸收關(guān)節(jié)液中的營養(yǎng)物質(zhì)。組織培養(yǎng)法保存軟骨與體內(nèi)軟骨相比缺乏必需的應(yīng)力刺激，影響軟骨細(xì)胞的正常代謝。Diao 等[14]發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)循環(huán)的壓力刺激可以使調(diào)控軟骨生成的基因 SOX9 表達(dá)升高，同時(shí)降低軟骨細(xì)胞的代謝。楊健等[15]以一種非接觸性的力學(xué)加載形式作用于液體保存中的軟骨，對細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生積極的作用。但是不同強(qiáng)度的壓力對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的作用不同，不合適的壓力會(huì)對軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生負(fù)性作用[16]。以上實(shí)驗(yàn)表明適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激對軟骨細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生積極的作用，因此軟骨保存所需的應(yīng)力環(huán)境也是今后組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨方案的優(yōu)化方向。

2 保存液成分

隨著各種器官及組織移植技術(shù)的迅速發(fā)展，各國研究人員對組織培養(yǎng)液的研究越來越多。軟骨的組織培養(yǎng)液有很多種類，其中常用的組織培養(yǎng)液有最低必需培養(yǎng)液（Eagle's minimum essential medium，EMEM）、Iscove’s 改良培養(yǎng)液（IMDM）、Dulbecco’s 改良 Eagle 培養(yǎng)液（DMEM）、威斯康星大學(xué)液（UW 液）、RPMI1640 培養(yǎng)液以及乳酸林格液等。培養(yǎng)液的成分成為影響保存效果的重要因素，研究人員通過對已有培養(yǎng)液進(jìn)行處理，加入血清、蛋白、生長因子、細(xì)胞凋亡抑制劑、抗氧化劑等，使得軟骨保存的效果得到了提升。

2.1 血清

血清中含有豐富的細(xì)胞生長必需的營養(yǎng)成分，在細(xì)胞培養(yǎng)和軟骨組織的保存中都有應(yīng)用。Pennock 等[17]向 EMEM培養(yǎng)液中加入 10% 的新鮮胎牛血清（FBS）保存關(guān)節(jié)軟骨。在 4 ℃ 條件下保存 28 d 后，研究發(fā)現(xiàn)含有新鮮胎牛血清的保存液保存的軟骨細(xì)胞存活率可達(dá) 68%，而無血清的培養(yǎng)液保存的軟骨細(xì)胞活性只有 27%。但軟骨基質(zhì)中黏多糖的含量并沒有明顯的差異。Onuma 等[18]向 UW 液中加入10% 同種異體血清，4 ℃ 條件下保存小鼠軟骨。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞存活率和細(xì)胞外基質(zhì)成分均得到了提升，血清的加入一定程度上提高了保存效果，但是異體血清可能會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)以及增加疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 細(xì)胞生長因子

人體內(nèi)存在各種各樣的細(xì)胞生長因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長、修復(fù)，補(bǔ)充所需營養(yǎng)。Teng 等[19]利用含有胰島素樣生長因子（IGF-I）的 DMEM 培養(yǎng)液，4 ℃ 條件下保存牛關(guān)節(jié)軟骨，21 d 后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率高于不含胰島素樣生長因子培養(yǎng)液保存的軟骨，但 28 d 后細(xì)胞存活率迅速降低。Mickevicius 等[20]的研究也表明 IGF-I 在軟骨細(xì)胞的體外保存中可以在短時(shí)間內(nèi)起到延長保存時(shí)間，提高保存效果的作用。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)的生成[21]。

2.3 細(xì)胞凋亡抑制劑

細(xì)胞凋亡抑制劑在骨關(guān)節(jié)炎及軟骨體外保存的研究中得到了越來越多的應(yīng)用[22]。在軟骨保存期間，細(xì)胞凋亡基因隨著保存時(shí)間的延長會(huì)明顯上調(diào)，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡，其中包括腫瘤壞死因子 α（TNF-α）[23]和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）。依那西普是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎的有效藥物，屬于 TNF-α 抑制劑。Linn等[24]在 4 ℃ 條件下保存布爾山羊軟骨 28 d，發(fā)現(xiàn)含有依那西普的保存液保存的表層軟骨細(xì)胞存活率可以達(dá)到69.3%，TNF-α 的表達(dá)低于不含依那西普的對照組。但深層軟骨細(xì)胞的存活率較低，黏多糖成分和組織學(xué)觀察沒有明顯差異。Caspase 是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白酶，Teng 等[19]向 DMEM 培養(yǎng)液中加入 caspase 抑制劑 ZVAD-fmk，4 ℃下保存牛關(guān)節(jié)軟骨 21 d 發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡抑制劑可以使軟骨細(xì)胞存活率升高，但是繼續(xù)保存 28 d 后細(xì)胞存活率嚴(yán)重降低。

2.4 激素

激素在機(jī)體的生長、代謝、發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用，在軟骨細(xì)胞的代謝過程中也具有調(diào)節(jié)作用。Bian 等[25]在37 ℃ 下，用含有地塞米松的 DMEM 培養(yǎng)液保存牛關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)現(xiàn)含有地塞米松的 DMEM 培養(yǎng)液對于軟骨組織的保存有積極的效果，生物力學(xué)性能和細(xì)胞外基質(zhì)成分優(yōu)于不含地塞米松培養(yǎng)液保存的軟骨。表明地塞米松等激素可以成為延長保存效果的有效物質(zhì)。

2.5 其他

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從茶葉中提取的茶多酚，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎特性的物質(zhì)[26]。對于軟骨保存也有積極的意義。Bae 等[27]在 4 ℃ 條件下用含有 EGCG 的 RPMI1640PE 培養(yǎng)液保存髖關(guān)節(jié)軟骨和半月板，盡管細(xì)胞存活率在保存 14 d 和 28 d 后下降明顯，但是 EGCG 能夠延緩細(xì)胞存活率下降速度。氫氣是一種新型的選擇性抗氧化劑，同時(shí)具有抗凋亡、抗炎作用[28]，對多種疾病具有治療作用[29-31]，具有廣泛的應(yīng)用前景。Yamada等[32]用含有氫氣的保存液來保存小鼠關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)現(xiàn)氫氣可以提高軟骨保存效果。含有抗氧化、抗凋亡、抗炎特性物質(zhì)的保存液成為今后保存液研究的熱點(diǎn)。

3 總結(jié)與展望

多個(gè)臨床跟蹤研究證明了同種異體軟骨移植手術(shù)在臨床上的成功應(yīng)用[33-35]。美國同種異體軟骨移植手術(shù)數(shù)量近年迅速增多，由 2005 年的 660 例上升到 2011 年的 1619 例，同種異體軟骨移植成為治療關(guān)節(jié)軟骨疾病的重要方法[36]，而軟骨的體外保存效果成為軟骨移植手術(shù)成功與否的關(guān)鍵。目前我們可以從保存環(huán)境和保存液成分來改善軟骨的體外保存效果，使得同種異體軟骨移植手術(shù)得到廣泛應(yīng)用。未來軟骨保存液的研究將會(huì)從細(xì)胞通路、生長因子、應(yīng)力環(huán)境等方面入手，模擬人體關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境，解決軟骨保存過程中的問題，使同種異體軟骨移植手術(shù)的應(yīng)用更加廣泛和有效。

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2017-10-17