唐明青， 張文豪,2， 侯瑩， 成志云，郭思佳， 王立振， 劉慧， 許瑞安

(1. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350108)

超濾法去除重組腺相關(guān)病毒中內(nèi)毒素的應(yīng)用

唐明青1， 張文豪1,2， 侯瑩1， 成志云1，郭思佳1， 王立振1， 劉慧1， 許瑞安1

(1. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 福建 福州 350108)

為探討超濾法在重組腺相關(guān)病毒精制中的可行性，采用不同截留分子量的超濾管對重組腺相關(guān)病毒樣品rAAV9-Kal進行超濾處理.利用鱟試劑盒和qPCR法定量檢測截留液和濾過液中的內(nèi)毒素和病毒含量，評價超濾技術(shù)對樣品中內(nèi)毒素的去除效果.結(jié)果表明：在乙二胺四乙酸二鈉和脫氧膽酸鈉的預(yù)處理下，30 kD的超濾管對樣品的回收率及內(nèi)毒素去除率分別為0.912 2，0.870 6.因此，在單一超濾條件下，30 kD的超濾管是重組腺相關(guān)病毒樣品超濾純化的最佳選擇. 關(guān)鍵詞： 重組腺相關(guān)病毒； 超濾； 截留分子量； 內(nèi)毒素； 純化

重組腺相關(guān)病毒(rAAV)屬于微小病毒科的單鏈DNA病毒，具有天然非致病性、免疫原性低、宿主范圍廣、可轉(zhuǎn)染分裂細胞和非分裂細胞及介導(dǎo)外源基因長期表達等特性，是最有前景的基因治療載體之一[1].目前,基于rAAV的基因治療藥物Glybera已率先在歐盟上市[2].內(nèi)毒素(ET)是由革蘭氏陰性菌細胞壁裂解釋放的脂多糖類物質(zhì)，極微量(1～5 ng·kg-1)的內(nèi)毒素作用于機體內(nèi)的內(nèi)生致熱原生成細胞即可導(dǎo)致機體發(fā)熱，大劑量可引起血液循環(huán)障礙和內(nèi)毒素休克[3].在rAAV制備過程中,一個重要的質(zhì)控指標(biāo)就是內(nèi)毒素，尤其是應(yīng)用于臨床的rAAV，內(nèi)毒素安全限量為小于83.35 μkat·L-1[4].目前常用的內(nèi)毒素去除手段如活性炭吸附法、陰離子交換層析法和TritonX-114液相萃取法普遍存在選擇性低的問題，而高選擇性的親和膜色譜法又存在配基選擇、介質(zhì)合成困難、過程繁瑣、技術(shù)要求高的限制[5].超濾技術(shù)是通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對物質(zhì)進行選擇性分離，從而實現(xiàn)大、小分子的分離、濃縮、凈化的目的.雖然內(nèi)毒素單體的相對分子質(zhì)量僅為10～20 kD，但由于內(nèi)毒素通常以聚合態(tài)形式存在，其相對分子質(zhì)量可以高達1 000 kD以上.因此,超濾技術(shù)非常適合在小分子量產(chǎn)品中進行內(nèi)毒素的去除工作，如注射制劑及工程疫苗內(nèi)毒素的去除[6]，但其在rAAV這種超大分子量產(chǎn)品(大于10 000 kD)中的內(nèi)毒素去除效應(yīng)卻未見相關(guān)報道.為探討在rAAV制備中應(yīng)用超濾管進行rAAV濃縮與清除內(nèi)毒素的可行性，本文研究采用不同截留分子量(molecular weight cut off，MWCO)的超濾管，對實驗室制備的攜帶人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白基因(Kal)的rAAV9-Kal樣品進行超濾離心處理，收集濾過液和截留液進行內(nèi)毒素及病毒基因組(viral genome,VG)定量檢測和衣殼蛋白定性表征，以綜合評價超濾管對rAAV濃縮與內(nèi)毒素去除效果.

1 材料與方法

1.1 試劑耗材

rAAV9-Kal樣品由分子藥物教育部工程研究中心下轄的rAAV中試車間提供；Amicon Ultra-4超濾管(廈門市鷺隆生物公司)；快速銀染試劑盒(海門市碧云天生物技術(shù)研究所)；顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司)；SYBR Select Master Mix(上海市英濰捷基貿(mào)易有限公司)；定量PCR引物(南京市金斯瑞生物科技有限公司)；小鼠抗VP1/VP2/VP3單克隆抗體和兔抗小鼠IgG單克隆抗體(上海市英濰捷基貿(mào)易有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(廈門市鷺隆生物公司).

1.2 Realtime PCR引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中人Kallistatin基因序列(L19684.1)，使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列為

Kal-S: 5′-GCTGTCTGAGTCCGATGTCC-3′，

Kal-AS: 5′-TGTCGTAGAAGTTGGTGTGG-3′，擴增產(chǎn)物長度191 bp.

1.3 超濾離心

取rAAV9-Kal(2.5×1012VG·L-1)4 mL，分別加于MWCO為3,10,30,50,100 kD的Amicon Ultra-4超濾管中，以7 500g，4 ℃，離心15 min收集截留液和濾過液.

1.4 內(nèi)毒素檢測

按照2010版《中華人民共和國藥典》吸光度法內(nèi)毒素檢測要求及顯色基質(zhì)鱟試劑盒使用說明進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、可靠性試驗、干擾實驗及內(nèi)毒素測定.提前配制顯色基質(zhì)溶液、偶氮化試劑1、偶氮化試劑2、偶氮化試劑3，用內(nèi)毒素檢查用水配制活性濃度為0.10,0.25,0.50,16.67 μkat·L-1細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液.按標(biāo)示量，加細菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，并輕輕振搖使其溶解完全.

在裝有100 μL加內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液或經(jīng)超濾處理后的待測rAAV9-Kal樣品(截留液和濾過液)的無熱原試管中，加入100 μL鱟試劑溶液，混勻，在37 ℃溫育10 min.接著，加入100 μL顯色基質(zhì)溶液，混勻，再次在37 ℃溫育6 min.溫育結(jié)束，依次加入500 μL偶氮化試劑1、偶氮化試劑2、偶氮化試劑3，每次加完試劑后均混勻，并在加入偶氮化試劑3混勻后室溫靜置5 min，于545 nm波長處測吸光度值，每個檢測反應(yīng)設(shè)3個平行管.

1.5 定量檢測

分別取2 μL的截留液及超濾液、10 μL的2×SYBR Select Master Mix、0.5 μL的引物Kal-S及Kal-AS，7 μL的純水，在StepOne Plus定量PCR儀上運行.95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán).最后，進行相對定量計算，即

1.6 病毒鑒定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%的濃縮膠，分別取截留液及超濾液25 μL，加入5 μL蛋白上樣緩沖液.煮沸變性5 min，每孔上樣28 μL，60 V恒壓電泳分離；電泳結(jié)束后進行PVDF膜轉(zhuǎn)膜，條件為250 mA，2 h；隨后小鼠抗VP1/VP2/VP3單克隆抗體4℃孵育過夜，兔抗小鼠IgG單克隆抗體室溫孵育2 h，ECL顯色，置于凝膠成像系統(tǒng)中顯影、定影.

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，不同實驗組間病毒及內(nèi)毒素水平用x表示.

2 實驗結(jié)果

2.1 rAAV9-Kal的回收率

收集不同規(guī)格超濾管超濾后的濾過液(3kD-P，10kD-P，30kD-P，50kD-P，100kD-P)、截留液(3kD-R，10kD-R，30kD-R，50kD-R，100kD-R)、原液(rAAV9-Kal)并統(tǒng)一稀釋至4 mL初始體積，通過qPCR儀進行滴度相對定量.在統(tǒng)一體積條件下，定量計算rAAV9-Kal的回收效率，如表1所示.

由表1可知：MWCO為3，10，30，50，100 kD的超濾管對rAAV9-Kal進行超濾(7 500g，4 ℃，15 min)后的產(chǎn)品回收率分別為0.957 0，0.941 3，0.919 9，0.842 0，0.642 5.鑒于前3者對產(chǎn)品的損傷率均小于10%，因此，單純考慮產(chǎn)品回收率時，在實際rAAV超濾中，以選擇MWCO為3，10，30 kD的超濾管為佳.

表1 rAAV9-Kal的回收率測定Tab.1 Recovery rate of rAAV9-Kal samples

2.2 rAAV9-Kal的內(nèi)毒素去除率

超濾管超濾后，收集不同規(guī)格的濾過液、截留液、原液，并統(tǒng)一稀釋至4 mL的初始體積，通過鱟試劑盒測定各自內(nèi)毒素活力，發(fā)現(xiàn)超濾前樣品的內(nèi)毒素活力為31.006 nkat·mL-1，經(jīng)MWCO為3，10，30，50，100 kD的超濾管超濾后截留液的內(nèi)毒素活力分別為30.173,30.006,28.893,24.005,17.504 μkat·L-1，其對應(yīng)的截留率分別為0.998 7，0.987 7，0.982 263，0.944 1，0.785 8，0.573 0，而濾過液的內(nèi)毒素活力分別為1.000,3.501,4.501,6.001,10.169 nkat·mL-1，其對應(yīng)的濾過率分別為0.032 8，0.114 6，0.147 3，0.196 5，0.332 9，如圖1所示.

圖1中：管號1～10分別為3k-R，10k-R，30k-R，50k-R，100k-R，30k-P，10k-P，50k-P，100k-P,3k-P.由圖1可知：內(nèi)毒素的濾過率雖然隨著MWCO增大而增大，但基本不能透過MWCO小于30 kD的超濾管，去除效率并不理想，超濾工藝有待進一步優(yōu)化.

(a) 內(nèi)毒素檢測實驗 (b) 內(nèi)毒素活力統(tǒng)計圖1 rAAV9-Kal的內(nèi)毒素檢測Fig.1 Endotoxin analysis of rAAV9-Kal samples

2.3 超濾工藝的優(yōu)化及效果

用質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的脫氧膽酸鈉(DOC)預(yù)處理rAAV9-Kal樣品30 min(冰浴攪拌)，再用3，10，30 kD的超濾管進行超濾處理，分析濾過液和截留液中rAAV9-Kal的滴度及內(nèi)毒素的活力變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品預(yù)處理后，超濾管對rAAV9-Kal的濾過性有輕微增加，但對內(nèi)毒素的濾過性則有顯著性增大.

rAAV9-Kal回收率及內(nèi)毒素去除率測定，如表2所示.由表2可知：3，10，30 kD的超濾管對樣品的回收率分別為0.953 0，0.938 5和0.9122，對內(nèi)毒素的去除率分別為0.772 3，0.831 4和0.870 6.綜合考慮超濾時間、回收率、內(nèi)毒素去除率等因素，30 kD超濾管可以作為rAAV9-Kal樣品超濾純化的基本選擇.其純化效果還可以通過進一步優(yōu)化樣品預(yù)處理的條件實現(xiàn)進一步優(yōu)化.

表2 rAAV9-Kal回收率及內(nèi)毒素去除率測定Tab.2 Recovery rate of rAAV9-Kal and removal rate of endotoxin in samples

圖2 rAAV9-Kal的衣殼蛋白檢測Fig.2 Capsid protein analysis of rAAV9-Kal samples

2.4 超濾純化后rAAV的鑒定

收集不同規(guī)格超濾管超濾后的濾過液、截留液、原液并統(tǒng)一稀釋至4 mL初始體積，通過WB對各組分進行定性鑒定，如圖2所示.圖2 中：泳道1～3分別為3kD-R，10kD-R，30kD-R.由圖2可知：在超濾條件優(yōu)化后，MWCO為3，10，30 kD的超濾管超濾后截留液中rAAV9-Kal的目的條帶完整(VP1，VP2，VP3)且比例正確(1∶1∶10)；優(yōu)化后的超濾處理并不影響回收對象rAAV9-Kal的物理性質(zhì).

3 討論

超濾離心的原理是以特定孔徑的微孔濾膜為過濾介質(zhì)，在一定的離心力作用下，使待處理液體經(jīng)過超濾管，迫使小分子物質(zhì)和溶劑經(jīng)過膜面進入下部的收集管，而大分子物質(zhì)被截留從而達到濃縮和分離的目的[7].由于此類方法操作簡便，對設(shè)備要求不高，加上超濾管經(jīng)再生處理后可重復(fù)使用，在注射制劑中內(nèi)毒素的去除上已初見成效，但尚未有關(guān)其在rAAV產(chǎn)品純化與內(nèi)毒素去除方面的研究報道.

通過選用不同截留分子量的超濾管對rAAV9-Kal樣品進行超濾離心處理，以期獲得一種能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品純化與內(nèi)毒素去除的超濾條件.實驗結(jié)果表明：在7 500g，4 ℃，15 min 超濾條件下，MWCO小于30 kD的超濾管對rAAV樣品具有較高的回收率，最低為0.919 9，但此時內(nèi)毒素去除率并不理想，最高僅為0.017 8，超濾工藝有待進一步優(yōu)化.

通過對內(nèi)毒素自身性質(zhì)的分析可以發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素具有化學(xué)異源性，來源不同的內(nèi)毒素形態(tài)和相對分子質(zhì)量均不確定，相對分子質(zhì)量變化范圍可從幾千到幾萬，而且在水溶液中存在多種分散形態(tài)，如膠束和締合體，尤其是締合體的分子質(zhì)量可達1 000 kD，直徑達10 nm[8].

由于rAAV是經(jīng)過氯化銫梯度離心后的半成品，此時樣品中所含內(nèi)毒素的分子量及物理尺寸與分離對象rAAV極為相似，因此，樣品中殘留的內(nèi)毒素主要以締合體形式存在[9]，進而可能導(dǎo)致本實驗中內(nèi)毒素與rAAV樣品的分離效果差.其次，內(nèi)毒素在Ga2+等二價陽離子的存在下極容易聚合，而rAAV在制備過程中正好需要使用一定質(zhì)量濃度的GaCl2及MgCl2.因此，在超濾優(yōu)化中嘗試采用去污劑DOC及螯合劑EDTA預(yù)處理樣品，以實現(xiàn)將聚合態(tài)內(nèi)毒素解聚，從而降低其分子量.最終優(yōu)化后超濾效果表明:樣品預(yù)處理后，超濾管對rAAV9-Kal的濾過性有輕微增加，但對內(nèi)毒素的濾過性則有顯著性增大.30 kD的超濾管對樣品的回收率及內(nèi)毒素去除率分別為0.912 2和0.870 6，優(yōu)化效果明顯，可以作為rAAV9-Kal樣品超濾純化的基本選擇.

4 結(jié)束語

雖然建立了rAAV超濾純化的初步工藝，但鑒于不同超濾材質(zhì)的超濾效果存在明顯差異[10-11]，離心型和泵驅(qū)動型超濾裝置在膜分離動力學(xué)方面存在差異[12]，溶液中蛋白質(zhì)量濃度和去污劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都可能影響到實際的內(nèi)毒素清除效果[13].在接下來的研究中，將重點開展相關(guān)條件的系統(tǒng)優(yōu)化，以求實現(xiàn)rAAV樣品純化與內(nèi)毒素清除的快捷、簡單化，為規(guī)?；R床級rAAV的制備奠定基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯： 陳志賢 英文審校： 劉源崗)

Removal of Endotoxin From Recombinant Adeno-Associated Virus by Ultrafiltration

TANG Mingqing1, ZHANG Wenhao1,2, HOU Ying1,CHENG Zhiyun1, GUO Sijia1， WANG Lizhen1,LIU Hui1, XU Ruian1

(1. School of Biomedical Sciences, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China;2. School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China)

To explore the possibility of ultrafiltration technology used in recombinant adeno-associated virus purification, the recombinant adeno-associated virus sample termed rAAV9-Kal was first treated by different molecular weights cut off ultrafiltration devices, then the endotoxin and virus in the retentates and filtrates were assayed with quantitative tachypleus amebocyte lysate regents and real-time PCR respectively, and last the effects of ultrafiltration on endotoxin removal were evaluated. The results showed that the recovery rate and endotoxin removal rate of sample were 0.912 2 and 0.870 6 respectively, under the treatment of EDTA, DOC and 30 kD ultrafiltration devices. Therefore, the 30 kD should be the most suitable ultrafiltration device for sample ultrafiltration and endotoxin removal. Keywords： recombinant adeno-associated virus; ultrafiltration; molecular weights cut off; endotoxin; purification

10.11830/ISSN.1000-5013.201701012

2016-06-29

唐明青(1982-)，男，副教授，博士，主要從事AAV基因治療的研究.E-mail:Tangmingqing2222@163.com

國家自然科學(xué)基金資助項目(2012AA020810); 福建省中青年教師教育科研項目(JA14020); 華僑大學(xué)科研基金資助項目(14BS111)

Q 93

A

1000-5013(2017)01-0064-05