劉小鈺 宋敏* 蔣林博 周靈通 董萬(wàn)濤 鞏彥龍

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種隱匿性疾病[1]，骨代謝異常疾病[2]。根據(jù)病因分為原發(fā)性(Ⅰ型-高代謝轉(zhuǎn)化型、Ⅱ型-低代謝轉(zhuǎn)化型)、繼發(fā)性和特發(fā)性，病理變化為骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨強(qiáng)度下降。臨床表現(xiàn)有腰背或周身疼痛、脊柱變形、骨折。流行病學(xué)調(diào)查研究，約50%的女性和20%的男性因OP有患骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3]，20%～30%患者的死亡率與骨折后長(zhǎng)期固定及術(shù)后并發(fā)癥相關(guān)[4]。我國(guó)目前已經(jīng)進(jìn)入社會(huì)老齡化階段，因此，積極治療和預(yù)防OP顯得尤為重要。祖國(guó)醫(yī)學(xué)將OP歸屬為“骨瘺”、“骨枯”、“骨痹”范疇，因先天稟賦不足、后天飲食不節(jié)、久病失治、臟器損傷，致脾腎兩虛，髓空骨枯而發(fā)病。中藥補(bǔ)骨脂(Psoralea Corylifolia Linn)味辛、苦，性溫，歸脾、腎經(jīng)，有補(bǔ)腎助陽(yáng)、溫脾等功效[5]，主治腎虛腰痛、骨瘺、骨痹，其活性成分具有促成骨細(xì)胞分化、增殖的作用，成為防治OP的研究熱點(diǎn)[6,7]。本文將進(jìn)一步探討補(bǔ)骨脂活性成分對(duì)OP相關(guān)信號(hào)通路的影響，以期開展更深層次的基礎(chǔ)研究，指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1 補(bǔ)骨脂抗骨質(zhì)疏松的活性成分

補(bǔ)骨脂活性成分主要有香豆素類、黃酮類、萜酚類等，其中抗骨質(zhì)疏松作用的主要有[7,8]：補(bǔ)骨脂素(psoralen)、異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)、甲氧補(bǔ)骨脂素(methoxy psoralen)、補(bǔ)骨脂定(psoralidin)、補(bǔ)骨脂黃酮(bavachalcone)、補(bǔ)骨脂二氫黃酮(bavachlin)、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮(isobavaenin)、異補(bǔ)骨脂查耳酮(isoba-vacalcone)、補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)等。藥理學(xué)研究表明香豆素類成分、黃酮類成分為抗骨質(zhì)疏松的主要活性物質(zhì)，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)骨形成[9,10]。黃酮類成分還具有類似于植物雌激素樣的作用，毒副作用低微，避免了雌激素的致癌作用，可替代雌激素長(zhǎng)期服用[11]。另外，在補(bǔ)骨脂雌激素樣作用有效成分的研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂酚能夠通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素水平促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖[12]。也有研究證明補(bǔ)骨脂酚能減緩去卵巢小鼠的骨質(zhì)損耗[13]，在提高成骨細(xì)胞分化與增殖的作用方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用。因此，大量基礎(chǔ)研究成果表明，補(bǔ)骨脂活性成分在開發(fā)抗骨質(zhì)疏松新藥方面具有很大潛力，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重要的意義。

2 對(duì)骨質(zhì)疏松相關(guān)信號(hào)通路的影響

2.1 對(duì)BMPs/TGF-β通路的影響

BMPs/TGF-β信號(hào)通路在骨代謝中負(fù)責(zé)調(diào)控成骨細(xì)胞的分化與增殖[14]。骨成型蛋白(BMPs)是一種廣泛存在于骨基質(zhì)中的酸性糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)超家族中最大的一組，目前已有20余種，其中BMP-2在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化與促進(jìn)骨形成的作用中占有重要地位。Smads為BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，分9個(gè)亞型，Smad1-9。BMP-2與骨密度的降低及骨折風(fēng)險(xiǎn)度緊密關(guān)聯(lián)，BMP-4基因的多態(tài)性也曾被證明與老年性骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。BMP-2和BMP-4與相應(yīng)細(xì)胞表面受體結(jié)合，并誘導(dǎo)靶基因(Smad1/5/8)磷酸化，磷酸化的Smad1/5/8與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與不同的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，激活骨特異性基因的轉(zhuǎn)錄，作用于骨細(xì)胞，刺激骨形成。另外，BMP還能上調(diào)Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen, ColⅠ)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)等的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

Tang DZ等[15]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素能夠激活骨成型蛋白，上調(diào)BMP-2與BMP-4基因的表達(dá)，增強(qiáng)Smad1/5/8的磷酸化水平，增強(qiáng)BMP信號(hào)的直接靶基因成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osx)的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與增殖。在補(bǔ)骨脂素對(duì)BMP-2、BMP-4表達(dá)的影響及BMP信號(hào)的研究中，相關(guān)qPCR數(shù)據(jù)顯示，補(bǔ)骨脂素能夠顯著增加成骨細(xì)胞中BMP-2與BMP-4的mRNA表達(dá)，為確定補(bǔ)骨脂素是否能夠激活下游BMP相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，測(cè)量發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素水平為10與100μmol/L時(shí)能夠顯著增加初級(jí)成骨細(xì)胞中Smad1/5/8的磷酸化平[16]。這進(jìn)一步證實(shí)了補(bǔ)骨脂素能夠激活成骨細(xì)胞分化的BMP信號(hào)。

異補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠胚胎前成骨細(xì)胞TGF-β受體蛋白的表達(dá)也具有一定的影響，研究結(jié)果顯示異補(bǔ)骨脂素能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和ColⅠ的分泌，刺激TGF-βⅠ、Ⅱ型受體蛋白的表達(dá)[17，18]，表明異補(bǔ)骨脂素可通過(guò)BMP/TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖及骨膠原基質(zhì)的合成，加快成骨細(xì)胞中鈣鹽的沉積，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。另有研究也證實(shí)了這一結(jié)論，在異補(bǔ)骨脂素加鋅對(duì)大鼠成骨細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌激素組、異補(bǔ)骨脂素組、異補(bǔ)骨脂素加鋅組均能增強(qiáng)大鼠成骨細(xì)胞中ColⅠmRNA、OsxmRNA、Smad4mRNA的表達(dá)，其中加鋅組表達(dá)量明顯高于雌激素組和異補(bǔ)骨脂素組(P<0.05)，異補(bǔ)骨脂素組與加鋅組均可促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌TGF-βI，同時(shí)上調(diào)Smad4mRNA的表達(dá)[19]。大量基礎(chǔ)研究成果也均表明異補(bǔ)骨脂素對(duì)成骨相關(guān)因子的表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用[20-24]，對(duì)BMP/TGF-β信號(hào)通路存在直接或間接的影響。

孔西建等[10]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂黃酮能刺激體外培養(yǎng)的乳鼠顱骨成骨細(xì)胞骨相關(guān)蛋白(OC、BMP-2、OPN和ColⅠ)的分泌，增強(qiáng)成骨相關(guān)基因Runx-2、Osx的表達(dá)，顯著提高ALP的活性。推測(cè)補(bǔ)骨脂黃酮可能是通過(guò)對(duì)BMP/TGF-β信號(hào)通路的干預(yù)來(lái)刺激成骨細(xì)胞的分化，增加結(jié)節(jié)數(shù)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化成熟，防治骨質(zhì)疏松。

2.2 對(duì)EphB/EphrinB通路的影響

研究發(fā)現(xiàn)EphB4/EphrinB2正向信號(hào)通路能夠使ERK1/2磷酸化，抑制RhoA激酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[25]。雌激素受體ER作為一種轉(zhuǎn)錄因子[26]，對(duì)EphB4/EphrinB2蛋白的翻譯或穩(wěn)定性有一定的調(diào)節(jié)作用。在青春期早期，體內(nèi)孕激素缺乏活性[27]，主要由雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)EphB4/EphrinB2信號(hào)通路影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖與分化。有研究結(jié)果顯示，在卵巢摘除模型小鼠雌激素缺失狀態(tài)下，添加相應(yīng)的EphB4-Fc、EphrinB2-Fc蛋白片段，通過(guò)EphB4/EphrinB2信號(hào)通路能夠上調(diào)BMSCs成骨分化過(guò)程中OPG的表達(dá)，再由OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路間接抑制破骨細(xì)胞的分化[28]。

運(yùn)用小鼠子宮增重法，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚對(duì)雌激素受體ERα的親和力是受體ERβ的3～5倍[12]。在乳腺癌中通常檢測(cè)到ERα高于ERβ，且明顯高于正常水平。上述結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂酚對(duì)ERα的高親和力作用較其他藥物能明顯降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，具有較高的雌激素樣作用。相關(guān)研究也顯示，補(bǔ)骨脂酚的植物雌激素樣作用能夠增加ALP、Ca2+、E2的濃度水平，提高骨礦物質(zhì)的水平，降低無(wú)機(jī)磷水平，對(duì)絕經(jīng)后婦女骨量的丟失起一定的防治作用[29，30]。

補(bǔ)骨脂定為擬雌激素內(nèi)脂類，具有明顯的雌激素樣作用。在補(bǔ)骨脂定抗實(shí)驗(yàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的效應(yīng)及機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血雌二醇(E2)、降鈣素(CT)含量明顯升高，股骨的骨密度顯著增加，切片觀察脛骨骨小梁充實(shí)、分布均勻，梁髓比正常，提示補(bǔ)骨脂定通過(guò)提高體內(nèi)雌激素的水平對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有一定的作用[31]。

綜上研究，雌激素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Eph/Ephrin信號(hào)通路影響成骨、破骨細(xì)胞的分化，推測(cè)補(bǔ)骨脂酚與補(bǔ)骨脂定抗OP的作用機(jī)制可能是通過(guò)提高體內(nèi)雌激素水平，調(diào)節(jié)Eph/Ephrin信號(hào)通路來(lái)影響骨代謝，促進(jìn)成骨分化，但其機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

2.3 對(duì)OPG/RANK/RANKL通路的影響

OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路在骨代謝方面主要誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟，調(diào)控骨吸收。RANKL(核因子-κB受體活化因子配體)可激活表達(dá)于破骨細(xì)胞受體的RANK(核因子-κB受體活化因子)，由RANKL介導(dǎo)的RANK激活之后，多個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)酶的表達(dá)增強(qiáng)并促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化、增殖、多核化、激活與生存。研究表明，影響該通路最重要的調(diào)節(jié)因子是核因子NF-κB[32，33]，絕經(jīng)后雌激素的缺乏刺激NF-κB的活化，使RANKL水平提高，骨的重吸收被上調(diào)，骨量丟失加速。OPG(骨保護(hù)素)主要由成骨細(xì)胞分泌，受體內(nèi)性激素的影響，是RANK/RANKL信號(hào)通路的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)高親和力與過(guò)量的RNAKL結(jié)合，防止RANK活化，抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟。

研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素可干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞OPG/核因子κB受體激活因子配體mRNA的表達(dá)，增加大鼠成骨細(xì)胞分泌OPG，下調(diào)RANKLmRNA的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，抑制骨吸收[34]。盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPGmRNA的表達(dá)與E2相比較弱，但證實(shí)了補(bǔ)骨脂素可以通過(guò)影響OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)錄與成骨分化的相關(guān)因子，抑制骨破壞，促進(jìn)骨形成。前面提到補(bǔ)骨脂素還可激活BMP/TGF-β信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，因此，在防治OP時(shí)，補(bǔ)骨脂素可同時(shí)作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，具有雙重效應(yīng)。

2.4 對(duì)ERK1/2、P13K-Akt通路的影響

MAPK信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)，主要包括ERK1/2通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路。膠原蛋白水解物可以刺激ERK1/2磷酸化，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化和增殖[35]。ERK1/2被激活后轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，可以激活下游的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞的生存、增殖和分化[36]。PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)方面也扮演著重要角色，PI3K/Akt激活后可以促進(jìn)ALP、BMP-2等成骨相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)[37]，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[38]。也有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路能夠網(wǎng)絡(luò)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化、增殖過(guò)程，調(diào)節(jié)成骨分化和破骨形成，從而維持骨穩(wěn)態(tài)[39]，成為研究的新靶點(diǎn)。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)為破骨細(xì)胞高分化的標(biāo)志性酶，在研究補(bǔ)骨脂單體成分對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，異補(bǔ)骨脂查耳酮對(duì)TRACP的活性無(wú)影響，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化及ALP的表達(dá)也無(wú)直接作用，而在低劑量0.05 μmol/L濃度下主要是通過(guò)干預(yù)ERK1/2、P13K-Akt信號(hào)通路來(lái)抑制破骨細(xì)胞的形成，促進(jìn)成骨分化，且作用顯著，與Park CK[40]等的研究相吻合。

2.5 對(duì)骨組織GABA通路的影響

γ-氨基丁酸(GABA)為哺乳動(dòng)物重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。具有降壓、改善腦循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、鎮(zhèn)靜、催眠、改善肝腎功等生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，骨組織GABA信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化，在骨重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與OP的發(fā)生有著密切聯(lián)系[41]，間接影響骨代謝，改善骨骼微環(huán)境。GABA能促進(jìn)生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)的分泌，使骨組織中IGF含量增加，刺激成骨細(xì)胞增殖、分化，但其研究相對(duì)較少。有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用補(bǔ)骨脂二氫黃酮給去卵巢大鼠灌胃12w后，與模型組相比，給藥組大鼠股骨骨密度升高，尿鈣值降低，骨組織中GABA和GABABRI的含量明顯減少，說(shuō)明補(bǔ)骨脂二氫黃酮能夠增加模型組大鼠骨密度，使神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用減緩，GABA及相關(guān)物質(zhì)的釋放減少，成骨的迫切性降低[11]，而在正常生理情況下，由于模型組大鼠骨量丟失嚴(yán)重及骨痛，將會(huì)使GABA的分泌增加，間接刺激成骨反應(yīng)。所以，當(dāng)體內(nèi)GABA大量聚集但又不能及時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，GABA可能通過(guò)GABABRI對(duì)成骨細(xì)胞的活性造成一定的抑制作用。推測(cè)補(bǔ)骨脂二氫黃酮可能是通過(guò)減緩富集的GABA對(duì)成骨細(xì)胞的抑制性影響，對(duì)OP起到一定的防治作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.6 對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響

Wnt/β-catenin為成骨分化經(jīng)典信號(hào)通路。胞外因子(Wnt)與膜受體結(jié)合后通過(guò)一系列胞質(zhì)蛋白的相互作用使胞內(nèi)β-catenin濃度升高，進(jìn)入胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)結(jié)合，誘導(dǎo)Runx2、Osx等的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的同時(shí)，還可以上調(diào)OPG的表達(dá)，抑制RANK與RANKL的結(jié)合，間接抑制破骨細(xì)胞的分化[42]。通過(guò)上述研究，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂活性成分在影響相應(yīng)信號(hào)通路的同時(shí)，均可直接或間接刺激成骨相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化；或上調(diào)OPG的表達(dá)，間接抑制破骨細(xì)胞的形成，最終影響骨代謝，維持骨穩(wěn)態(tài)，對(duì)OP起一定的防治作用。而Wnt/β-catenin信號(hào)通路的雙向作用，既能促進(jìn)Osx1向成骨細(xì)胞表達(dá)，又能刺激和分泌OPG，減少破骨細(xì)胞的形成，因此，補(bǔ)骨脂活性成分抗OP過(guò)程中對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能產(chǎn)生一定的影響，但具體是哪種成分的作用，機(jī)制較為模糊，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也甚少，需要進(jìn)一步研究與探討。

3 展望

骨質(zhì)疏松癥(OP)的發(fā)生主要由成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收平衡失調(diào)引起。對(duì)OP的研究有骨組織、細(xì)胞、分子水平。在細(xì)胞水平，主要是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的偶聯(lián)失衡引起。在分子水平，骨代謝相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用，為OP病理生理學(xué)的研究開辟了新領(lǐng)域。參與調(diào)控OP的各信號(hào)通路之間可能存在一定的聯(lián)系，共同影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化，但是大多數(shù)信號(hào)通路的機(jī)制尚不明確，各通路之間的相互聯(lián)系研究較少。尚有少量文獻(xiàn)報(bào)道，骨組織中的許多信號(hào)分子在生理刺激下或病理狀態(tài)下，能夠選擇性的激活PI3K/Akt信號(hào)通路的相關(guān)基因，同時(shí)作用于成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的各信號(hào)通路，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化，維持骨穩(wěn)態(tài)，可能成為OP研究的新途徑，但需大量基礎(chǔ)研究來(lái)證實(shí)。

由于西藥治療OP的局限性，大量基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向了對(duì)中醫(yī)藥的開發(fā)和利用，基于“骨肉不相親理論”，中醫(yī)認(rèn)為本病的發(fā)生與脾腎相關(guān)，脾主肌肉，腎主骨，因此，從脾腎論治OP，體現(xiàn)了中醫(yī)“治病必求于本”的思想，成為中醫(yī)藥研究、開發(fā)的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。補(bǔ)骨脂作為補(bǔ)腎壯骨的傳統(tǒng)中藥，其部分活性成分能夠干預(yù)骨質(zhì)疏松相關(guān)信號(hào)通路刺激成骨相關(guān)因子Runx2、Osx等的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制骨吸收，但各成分對(duì)各信號(hào)通路的部分靶點(diǎn)作用機(jī)制還不明了，而且PI3K/Akt信號(hào)通路可能作為調(diào)控成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化的相關(guān)信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)中心，成為研究OP的新靶點(diǎn)。因此，深入分子生物學(xué)水平，充分發(fā)掘補(bǔ)骨脂有效活性成分，使其精準(zhǔn)作用于骨代謝相關(guān)信號(hào)通路的靶點(diǎn)，并進(jìn)一步研究與論證其干預(yù)機(jī)制，發(fā)揮補(bǔ)骨脂的最優(yōu)藥用價(jià)值，成為后續(xù)工作者研究的主要方向，為后期開發(fā)抗骨質(zhì)疏松新藥提供理論依據(jù)，開辟新的道路，充分發(fā)揮中醫(yī)藥治療OP的特色優(yōu)勢(shì)，為廣大患者帶來(lái)福音。