蔡江瑜 艾承沖 盛旦丹 蔣佳 陳世益

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)在運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑研究中的進(jìn)展

蔡江瑜 艾承沖 盛旦丹 蔣佳 陳世益

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

運(yùn)動(dòng)對(duì)身體最直接的作用為重塑骨骼肌，但其潛在的分子機(jī)制仍不清楚。蛋白組學(xué)技術(shù)可為特定刺激物調(diào)節(jié)分子通路提供一個(gè)整體的視角，目前已在運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑的作用機(jī)制方面取得一定進(jìn)展。本文通過(guò)廣泛查閱近些年來(lái)有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑的蛋白組學(xué)研究報(bào)道，并進(jìn)行總結(jié)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)蛋白質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)有效地檢測(cè)出運(yùn)動(dòng)前后或運(yùn)動(dòng)組與安靜對(duì)照組骨骼肌差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過(guò)運(yùn)動(dòng)可引起骨骼肌的適應(yīng)性應(yīng)答，蛋白質(zhì)組會(huì)發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整。不同運(yùn)動(dòng)的類型、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以及肌纖維類型可引起骨骼肌蛋白質(zhì)組的不同變化。隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷完善和更多新技術(shù)的產(chǎn)生，蛋白組學(xué)研究會(huì)為闡明運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑及其改善健康的機(jī)制研究等做出更大的貢獻(xiàn)。

運(yùn)動(dòng)；骨骼??；重塑；蛋白組學(xué)；蛋白質(zhì)組

運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)身體健康有一定益處，最直接的作用為可以重塑骨骼肌[1]。不同類型、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)鍛煉可刺激相應(yīng)骨骼肌發(fā)生不同的微觀和宏觀的適應(yīng)性改變。近年來(lái)，許多學(xué)者致力于揭示運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑潛在的分子機(jī)制。但是，目前關(guān)于其機(jī)制的研究仍不夠深入。蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念是由澳大利亞Macquarie大學(xué)Wilkins和Williams在1994年提出，指由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織內(nèi)表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[2]。而蛋白組學(xué)（Proteomics）是研究在特定時(shí)間或環(huán)境下某個(gè)細(xì)胞或某種組織基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[3，4]。蛋白組學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法可為特定刺激物對(duì)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)提供一個(gè)整體的視角，更好地闡明運(yùn)動(dòng)對(duì)于骨骼肌重塑的影響。本文就蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)在運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑研究中的進(jìn)展作一綜述。

1 蛋白組學(xué)技術(shù)

蛋白組學(xué)技術(shù)可用于分析骨骼肌相關(guān)蛋白，通過(guò)蛋白組學(xué)分析可對(duì)肌肉的功能有更深入的了解。但是，骨骼肌包括功能多樣的纖維類型，在收縮動(dòng)力學(xué)、骨纖維蛋白亞型、代謝酶和線粒體密度上都有所不同[5，6]。對(duì)骨骼肌進(jìn)行復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分析在方法學(xué)上仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，且各個(gè)肌肉之間的不同特性加大了分析的難度[7]。骨骼肌能量需求較大，許多蛋白組學(xué)研究重點(diǎn)關(guān)注線粒體的相關(guān)蛋白[8，9]。同時(shí)，骨骼肌分泌蛋白質(zhì)組也是蛋白組學(xué)的重要研究對(duì)象，以用于發(fā)現(xiàn)肌肉釋放的可作用于局部或全身的分泌蛋白[10]。以下概述最常用的蛋白組學(xué)方法在運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑研究中的應(yīng)用。

1.1 基于凝膠的蛋白質(zhì)技術(shù)

蛋白電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)分離最常用的技術(shù)之一。二維凝膠電泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2DE）是根據(jù)蛋白質(zhì)在第一維中的等電點(diǎn)及第二維中的分子量的不同，使蛋白變性分離。2DE的優(yōu)點(diǎn)是具有高分辨率，可分離上千種蛋白，對(duì)于分析蛋白質(zhì)亞型和翻譯后修飾的特性描述十分有用[4，11]。目前大部分關(guān)于運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌蛋白質(zhì)組改變的數(shù)據(jù)來(lái)自于2DE。Burniston[12]通過(guò)2DE結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）證實(shí)了中等強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)可改變大鼠跖肌中15個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)，這些蛋白的變化表明大鼠體內(nèi)代謝途徑由糖酵解向脂肪酸氧化轉(zhuǎn)變。Fontana等[13]利用2DE結(jié)合質(zhì)譜串聯(lián)法（MS/MS）研究低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良模型小鼠（mdx鼠）股四頭肌的影響，結(jié)果顯示，相較于安靜對(duì)照組，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組中有4個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)有差異，其中，3個(gè)為碳酸酐酶3的亞型，顯著上調(diào)；另1個(gè)為超氧化物歧化酶，顯著下調(diào)。作者得出結(jié)論，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可通過(guò)阻礙氧化應(yīng)激，減緩mdx鼠肌肉中細(xì)胞變性過(guò)程。但是，2DE存在諸如難以分離低豐度蛋白、極端分子量或極端等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)以及極酸或極堿蛋白質(zhì)，重復(fù)性和靈敏度較差等問(wèn)題，研究者也在尋找和開(kāi)發(fā)其他新的分離方法。

雙向差異凝膠電泳（two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）是1997年由Unlu等首先報(bào)道[14]。它是在2DE的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種高效的蛋白質(zhì)分離方法，解決了2DE的一些技術(shù)難點(diǎn)[15]。這一方法是基于不同的熒光氰化物染料在蛋白質(zhì)賴氨酸氨基上顯色不同，對(duì)樣本蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，被標(biāo)記的蛋白等電點(diǎn)和相對(duì)分子量基本不受影響。等量混合標(biāo)記好的蛋白質(zhì)后進(jìn)行雙向電泳，蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化則通過(guò)不同的熒光強(qiáng)度來(lái)體現(xiàn)。與傳統(tǒng)雙向電泳方法相比，2D-DIGE具有高效性、檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍廣、定量精確、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。Egan等[8]指出，在研究骨骼肌線粒體蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異時(shí)，2-DE方法僅能使肌肉樣品中很少的線粒體蛋白溶解。另外，由于2-DE敏感性較低，線粒體蛋白無(wú)法準(zhǔn)確定位。作者利用2D-DIGE結(jié)合液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析8名受試者運(yùn)動(dòng)前后股外側(cè)肌內(nèi)線粒體蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異，結(jié)果顯示有31個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)表達(dá)差異。

1.2 基于非凝膠的蛋白質(zhì)技術(shù)

近些年來(lái)，基于非凝膠的蛋白質(zhì)分離技術(shù)因其高效、快速、高靈敏度、高自動(dòng)化程度等優(yōu)點(diǎn)被用于骨骼肌蛋白組學(xué)分析[9，16-19]。其中，多維液相色譜法（Multi?dimensional liquid chromategraphy methods，MDLC）因其良好的分辨率和更高的峰容量而備受關(guān)注，在蛋白質(zhì)樣品分離分析中得到廣泛的應(yīng)用[20]。特別是高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜連用，可以減小樣品損耗，且較低的蛋白含量也可被分析出來(lái)[21]。Ichibangase等[18]利用熒光衍生化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Fluoro?genicderivatization-high performance liquid chroma?tographytandem mass spectrometry，F(xiàn)D-HPLC-MS/MS）應(yīng)用于純血馬運(yùn)動(dòng)前后骨骼肌蛋白表達(dá)譜的分析，結(jié)果顯示有16種與能量代謝特別是無(wú)氧代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)。Schild等[19]報(bào)道高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（High performance liquid chroma?tography-electrospray ionization-tandem massspec?trometry，HPLC-ESI-MS/MS）用于分析未經(jīng)急性耐力運(yùn)動(dòng)和經(jīng)急性耐力運(yùn)動(dòng)的人群的骨骼肌蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示有92種蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)。在急性運(yùn)動(dòng)組中，肌肉纖維特定蛋白和氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)相關(guān)蛋白均顯著增加。

1.3 聯(lián)合凝膠和非凝膠技術(shù)的蛋白組學(xué)分析

在一些蛋白組學(xué)研究中，有研究者聯(lián)合凝膠和非凝膠的蛋白質(zhì)分離技術(shù)用于蛋白多維分離。通過(guò)凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，然后切取凝膠膠帶或膠點(diǎn)，用蛋白酶消化并作液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析（LCESI-MS/MS）。Hussey等[22]報(bào)道利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）聯(lián)合HPLC-ESI-MS/MS鑒定出糖尿病2型受試者股外側(cè)肌中共1329種蛋白，其中70種蛋白質(zhì)受運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。這種方法可以檢測(cè)到低豐度蛋白和膜蛋白，但是在蛋白質(zhì)定量檢測(cè)及差異表達(dá)分析方面仍存在挑戰(zhàn)。

2 運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌蛋白組學(xué)的影響

2.1 特定運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌生物學(xué)過(guò)程的影響

骨骼肌可對(duì)運(yùn)動(dòng)的不同類型（抗阻力運(yùn)動(dòng)、耐力運(yùn)動(dòng)），不同強(qiáng)度（低、中、高）和持續(xù)時(shí)間（急性、慢性）做出不同的蛋白水平的應(yīng)答。通過(guò)蛋白組學(xué)技術(shù)可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)規(guī)律。

一般來(lái)說(shuō)，運(yùn)動(dòng)可分為耐力運(yùn)動(dòng)和抗阻力運(yùn)動(dòng)，代表兩種能量消耗的形式，即有氧運(yùn)動(dòng)和無(wú)氧運(yùn)動(dòng)。雖然耐力和抗阻力運(yùn)動(dòng)均有利于身體健康，但骨骼肌的適應(yīng)性改變與這兩種特定的運(yùn)動(dòng)模式高度相關(guān)[23，24]。抗阻力運(yùn)動(dòng)和耐力運(yùn)動(dòng)會(huì)引起不同類型的收縮刺激，促使不同的通路進(jìn)行調(diào)控和蛋白應(yīng)答的發(fā)生[24，25]。具體而言，耐力運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)線粒體生物合成和骨骼肌纖維由快肌纖維向慢肌纖維轉(zhuǎn)變，這可能與AMPK-PGC-1α信號(hào)通路的激活有關(guān)；抗阻力運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌纖維類型影響較小，會(huì)因蛋白質(zhì)大量合成而使肌肉肥大，這可能與PKB-TSC2-mTOR信號(hào)通路有關(guān)[26]。Atherton等[26]將此結(jié)果歸納為“AMPK-PKB轉(zhuǎn)換”（AMPK-PKB switch）。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)組影響的研究顯示，相對(duì)于急性運(yùn)動(dòng)而言，慢性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生變化的蛋白質(zhì)數(shù)量更多[27]。據(jù)Padrao等[11]報(bào)道，有49種蛋白質(zhì)在急性和慢性運(yùn)動(dòng)中常規(guī)受到調(diào)節(jié)，其中大部分蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞呼吸和線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程中的功能蛋白。急性運(yùn)動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞氨基酸代謝過(guò)程、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)、鈣離子釋放入細(xì)胞質(zhì)和肌原纖維組裝，而慢性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)代謝前體物和能量的生成，三羧酸循環(huán)、肌肉收縮調(diào)節(jié)等過(guò)程的增強(qiáng)。研究顯示，相較于慢性運(yùn)動(dòng)，骨骼肌纖維在急性運(yùn)動(dòng)后對(duì)氨基酸的需求量更大。這種新陳代謝的變化可能有助于急性運(yùn)動(dòng)恢復(fù)期蛋白質(zhì)的合成和肌原纖維組裝[28]。在肌原纖維組裝過(guò)程中，支架蛋白如伴肌動(dòng)蛋白相關(guān)錨定蛋白（N-RAP）、Kelch相關(guān)蛋白1（Krp1）以及伴侶蛋白如熱休克蛋白90（Hsp90）、結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白70（Hsc70）及UNC-45蛋白對(duì)肌纖維生成起著重要的調(diào)節(jié)作用[29]。

通常根據(jù)最大攝氧量的區(qū)別，可將耐力運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度分為低、中、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（最大攝氧量分別＜60%，60%～80%和＞80%）。目前僅發(fā)現(xiàn)β-烯醇酶在任何運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度下均有變化[30-32]。成年人β-烯醇酶在快縮肌纖維中積聚最多，其中ββ亞型占所有烯醇酶含量的90%以上，對(duì)生理刺激十分敏感[33]。ββ亞型具有較高的親和力，易與糖酵解途徑相關(guān)的酶或肌鈣蛋白結(jié)合，作用于能量代謝，為肌肉收縮提供必需的能量[34]。運(yùn)動(dòng)主要影響骨骼肌吡啶核苷酸代謝NAD+，NADH的水平，以及線粒體ATP的生成[35]。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)主要影響吡啶核苷酸代謝，中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)主要影響代謝前體產(chǎn)物、酮代謝、三羧酸循環(huán)和肌絲滑動(dòng)，而低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)主要影響糖酵解途徑中的β-烯醇酶。

2.2 肌纖維類型對(duì)運(yùn)動(dòng)引發(fā)的蛋白質(zhì)組重構(gòu)的影響

肌纖維類型對(duì)運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)組的重塑也有影響[36]。根據(jù)肌纖維的收縮速度和代謝特征，可將其分為快縮-糖酵解型、慢縮-氧化型[37]。兩種纖維在糖酵解、游離脂肪酸代謝、檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化等代謝過(guò)程相關(guān)的蛋白表達(dá)均存在差異[38]。而運(yùn)動(dòng)可引起兩種肌纖維類型中的ATP合成酶亞基5B、線粒體肌酸激酶、肌紅蛋白、葡萄糖磷酸變位酶-1和WD1重復(fù)蛋白等6種蛋白質(zhì)均受到調(diào)節(jié)[11]。Magherini等[32]比較快縮-糖酵解型（脛骨前肌）和慢縮-氧化型（比目魚(yú)?。┰谟醒踹\(yùn)動(dòng)前后蛋白表達(dá)的差異，結(jié)果顯示，脛骨前肌中有α-烯醇酶、β-烯醇酶、乳酰谷胱甘肽裂解酶、肌酸激酶M型、磷酸丙糖異構(gòu)酶和ES1蛋白同系物6種蛋白質(zhì)存在差異表達(dá)，其中糖酵解相關(guān)的酶（α-烯醇酶、β-烯醇酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶）均出現(xiàn)下調(diào)，表明脛骨前肌作為快縮-糖酵解型肌肉，在有氧運(yùn)動(dòng)過(guò)程中其代謝途徑可能部分向有氧代謝轉(zhuǎn)換；而比目魚(yú)肌中僅有線粒體NADH脫氫酶1α子復(fù)體2和延伸因子Tu兩種蛋白存在差異表達(dá)，均出現(xiàn)下調(diào)。Roca-Rivada等[10]比較快縮-糖酵解型（腓腸肌）和慢縮-氧化型（比目魚(yú)?。┘∪夥置诘鞍捉M學(xué)，發(fā)現(xiàn)19種蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)，且經(jīng)耐力運(yùn)動(dòng)后在腓腸肌和比目魚(yú)肌中分別產(chǎn)生了10種和17種獨(dú)特的分泌蛋白。其中，DJ-1蛋白在腓腸肌中更為豐富，而脂肪酸結(jié)合蛋白-3（FABP-3）則在比目魚(yú)肌中含量更高。作者認(rèn)為DJ-1蛋白與肌肉收縮后的氧化應(yīng)激有關(guān)，而FABP-3與脂質(zhì)代謝有關(guān)。

綜上所述，通過(guò)蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)可對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)組做一整體而深入的研究。運(yùn)動(dòng)可引起骨骼肌的適應(yīng)性應(yīng)答，蛋白質(zhì)組會(huì)發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整。不同運(yùn)動(dòng)的類型、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間以及肌纖維類型可引起骨骼肌蛋白質(zhì)組的不同變化。目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑蛋白組學(xué)研究正在開(kāi)展，但仍存在一定的技術(shù)難點(diǎn)。隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷完善和更多新技術(shù)的產(chǎn)生，蛋白組學(xué)研究會(huì)為闡明運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌重塑及其改善健康的機(jī)制研究等做出更大的貢獻(xiàn)。

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2016.08.04

第1作者：蔡江瑜，Email：caijiangyu1@126.com；

陳世益，Email:cshiyi@163.com