趙子德，張瑩瑩，柏 梅，梁 俊，王軍杰，魏彬彬，王 影△

(1. 中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院，北京 100041； 2. 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700)

視神經(jīng)萎縮是由他病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突變性，表現(xiàn)為嚴重的視功能受損，尚無有效的治療措施。唐由之教授是我國著名的中醫(yī)眼科學家，在視神經(jīng)萎縮(optic atrophy, OA)的中藥治療中積累了豐富的臨床經(jīng)驗，提出“補虛化瘀法”，并圍繞其經(jīng)驗方補腎益氣明目方(黨參、丹參、川芎、山茱萸、菟絲子、枸杞子、女貞子、生芪、熟地、當歸)加減，臨床收效顯著[1]。

復方多藥物組合及藥物多組分給臨床藥理研究帶來極大挑戰(zhàn)。理清藥物-疾病靶向關(guān)系對揭示復雜藥理機制極為必要?！吧锘钚詫蛳碌幕瘜W研究思路”的提出，重視以中藥有效組分配伍的方劑架構(gòu)新模式[2]，因此借助開放生物數(shù)據(jù)平臺，以中藥組分作用靶點為分析單元的臨床藥理研究，展現(xiàn)了極強的驅(qū)動力[3-5]。本研究擬基于該平臺，對唐由之治療視神經(jīng)萎縮之補腎益氣明目方，通過數(shù)據(jù)挖掘初步探索該方有效組分及分子靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥物有效組分及其靶點篩選

本研究通過檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP: Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http:∥ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，在草藥名稱“Herb name”中分別輸入各個中藥中文名稱，進入搜索“Search”后，再點擊結(jié)果中顯示的所輸入中藥的拉丁名稱，在相關(guān)靶點“Related Targets”內(nèi)容中，便可獲取補腎益氣明目方中10味中藥相關(guān)的化合物及各化合物對應的分子靶點，在此基礎上，結(jié)合藥物靶點和藥物作用信息數(shù)據(jù)庫Drugbank(http:∥www.drugbank.ca/檢索時間2015-7-18)，從中提取上述各中藥已被驗證的有效組分及其對應的分子靶點信息。

1.2 OA疾病靶標獲取

利用囊括人類遺傳、基因表型及疾病基因圖譜數(shù)據(jù)庫OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man http:∥omim.org/檢索時間2015-11-29)，以“optic atrophy”為檢索詞進行搜索，從顯示結(jié)果中便可獲取數(shù)據(jù)庫中收集的OA致病相關(guān)分子，將此作為本次研究的疾病靶標。

1.3 藥物-疾病靶向分析

藥物作用被歸類為“中靶”與“脫靶”兩種效應，藥物直接擾動致病分子是靶向治療的主要形式。通過篩選具有直接擾動OA分子靶標的藥物、有效組分及其靶點信息，利用文獻挖掘與信號通路數(shù)據(jù)庫KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.kegg.jp)進行信號通路信息比對，初步探索其靶向機制。

2 結(jié)果

2.1 藥物組分及其靶點

通過檢索中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺，從中提取補腎益氣明目方中各中藥已被Drugbank數(shù)據(jù)庫驗證的有效組分，得到黨參、熟地、丹參、當歸、川芎、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪被驗證的組分數(shù)目分別為11、5、20、6、14、14、22、19、7、13；上述各藥物有效組分涉及的靶點基因符號(gene symbol)數(shù)目分別為133、48、180、28、138、172、135、285、156、218。

2.2 OA疾病靶標

通過OMIM數(shù)據(jù)庫獲得視神經(jīng)萎縮疾病相關(guān)靶標分子(Gene Symbol)379個。

2.3 藥物-疾病靶向分析

通過將經(jīng)驗方中各藥物靶點與視神經(jīng)萎縮靶標進行比對，本研究最終確定上述10味中藥中的有效組分直接擾動視神經(jīng)萎縮靶標分子數(shù)目分別為1、0、2、0、0、3、2、3、5、3，其中涉及5個有效組分luteolin(木犀草素)、protocatechuic acid(原兒茶酸)、quercetin(槲皮素)、vitamin A(維生素A)和sesamin(芝麻脂素)，5個直接擾動靶標EGFR(Epidermal growth factor receptor)、KIF21 A(Kinesin family member 21 A)、GJA1(Gap junction alpha-1)、ACOX1(Acyl-CoA oxidase 1)、G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)。

3 討論

研究表明，攻擊單個靶標對于復雜疾病幾乎沒有影響[6]，這可能源于系統(tǒng)具有魯棒性，而抑制多個靶標比單一抑制更加有效，因此設計多靶點干預的有效藥物組合極具挑戰(zhàn)。本文針對補腎益氣明目方10味組方藥物的直接作用靶點和OA疾病靶標進行挖掘，OA顯示其多基因復雜疾病特點，所有藥物均呈現(xiàn)多組分多靶點特征，其中黨參、丹參、枸杞子、山茱萸、女貞子、菟絲子、生芪的有效組分能直接干預OA靶標，且藥物中靶顯示出高度集中性。其中，菟絲子所含有效組分(sesamin、quercetin)占有最高“中靶率”，并呈現(xiàn)多角度干預。

3.1 促神經(jīng)細胞的生成及穩(wěn)態(tài)

結(jié)果顯示，黨參、丹參、枸杞子、女貞子、菟絲子、黃芪均可直接直接調(diào)控EGFR分子。EGRF是一種絡氨酸激酶受體(RTK)，研究表明EGFR與配體結(jié)合促進自噬體與溶酶體的融合，從而維持神經(jīng)膠質(zhì)細胞的穩(wěn)定狀態(tài)[7]，防止細胞變性，而在受損區(qū)域星形膠質(zhì)細胞可以形成不成熟的神經(jīng)細胞[8]，隨后又發(fā)育為成熟的神經(jīng)細胞。而在果蠅體內(nèi)，EGFR與配體Spitz(一種被視為轉(zhuǎn)移生長因子-α樣配體)結(jié)合時能促進神經(jīng)上皮的增殖和成神經(jīng)細胞的形成[9]。另外，利用軸突蛋白tau和神經(jīng)元蛋白β微管蛋白/神經(jīng)絲評估神經(jīng)元細胞培養(yǎng)過程中軸突再生程度時發(fā)現(xiàn)，當EGFR過表達時Tau蛋白和β微管蛋白/神經(jīng)絲被上調(diào)，在EGFR被阻斷時后者被下調(diào)[10]，同時這種調(diào)控模式被發(fā)現(xiàn)存在于EGFR與mTOR和Akt之間，mTOR和Akt則在胎兒鼠和幼鼠的神經(jīng)元細胞中高度表達，而在老年鼠中低表達，這表明EGFR在mTOR和PI3K / Akt通路激活條件下具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元固有再生的重要潛力。

3.2 胞間信號傳導及運輸動力調(diào)控

GJA是枸杞子、山萸肉、女貞子、菟絲子、黃芪共同的目標調(diào)控分子,是一種間隙連接蛋白，這種蛋白在人類視神經(jīng)網(wǎng)膜組織中主要表達于神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管和上皮細胞，并參與線粒體基質(zhì)離子流動和呼吸調(diào)節(jié)。6個連接蛋白形成一個連接子或質(zhì)膜半通道，這種通道具有相對非特異性，允許小于1000道爾頓的分子以被動擴散的形式通過，如可以影響細胞發(fā)育命運被稱為形態(tài)發(fā)生素的一組生化分子等。在病理條件下，損傷的細胞可能通過間隙連接影響周圍健康細胞，相反必要的營養(yǎng)物質(zhì)也可以通過間隙連接供給臨近健康細胞而避免損傷。研究表明,間隙連接蛋白可能牽連著中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元死亡的病理[11]。利用基因敲除/敲入技術(shù)，連接蛋白被證實對腦組織缺血再灌注損傷具有重要保護作用[12]。在誘導細胞毒性或缺血條件下，間隙蛋白的藥理阻斷還可以終止幾乎所有視網(wǎng)膜無長突細胞的丟失以及降低大部分神經(jīng)節(jié)細胞的丟失[13]。此外，EGFR和GJA同位于間隙連接通路(Gap junction pathway)的上游位置，且該通路顯示涉及視皮層與視網(wǎng)膜功能、細胞凋亡、鈣離子平衡等調(diào)控。間隙連接包含細胞間通道，不同于體內(nèi)神經(jīng)、內(nèi)分泌交互機制，這允許相鄰細胞之間通過細胞質(zhì)進行短程通訊[14]。間隙連接通訊被認為不論對中樞神經(jīng)系統(tǒng)還是外周神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘和軸突生存都至關(guān)重要[15]，分別通過介導少突-星形膠質(zhì)細胞間和雪旺氏細胞間的胞間通訊。在脫髓鞘神經(jīng)膠質(zhì)中，間隙連接調(diào)控著生理過程，如細胞的生長、增殖、鈣信號傳導以及參與連接蛋白構(gòu)成的半通道所釋放的神經(jīng)遞質(zhì)介導的細胞外信號傳導。因此，針對這類間隙蛋白的干預被認為是新的治療策略，以減少神經(jīng)病理條件下逐漸損失的細胞。

另外，KIF21 A是正端走向驅(qū)動蛋白家族中的一員，在神經(jīng)元中這一蛋白通過利用ATP水解釋放能量，沿軸突微管運輸必要細胞組分[16]，驅(qū)動蛋白活性的嚴格調(diào)節(jié)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)致病密切相關(guān)[17-18]，盡管較多的研究集中在KIF21 A與眼動神經(jīng)之間的關(guān)系。因此，方中藥物針對EGFR、GJA、KIF21 A的調(diào)控關(guān)系到胞間信號轉(zhuǎn)導及運輸動力調(diào)控等方面，可能涉及神經(jīng)細胞重要的物質(zhì)和能量代謝過程。

3.3 抑制退行進程與抗氧化

過氧化物酶體?；o酶A氧化酶是由ACOX1編碼的一種蛋白，ACOX1的缺乏是過氧化物酶體長鏈脂肪酸氧化的一種罕見性疾病，它的缺乏在人類可能引起包括視神經(jīng)萎縮在內(nèi)的致命性神經(jīng)退化過程，即神經(jīng)元的丟失導致持續(xù)脫髓鞘改變[19]，嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)異常在該基因敲除小鼠模型中同樣可以觀察到[20]。G6PD是一種存在于人體紅細胞內(nèi)、協(xié)助葡萄糖進行新陳代謝的酵素。研究表明，G6PD的缺乏可以降低缺血性視神經(jīng)病變的風險[21]，這可能是由于其缺乏而導致NADPH產(chǎn)生不足，降低NADPH依賴的氧化酶衍生的活性氧，保護組織或器官免受氧化損傷[22]。然而G6PD似乎是把雙刃劍，這源于其高表達在缺血再灌注期間又呈現(xiàn)出對抗DNA氧化損傷及防止神經(jīng)退行性病變等神經(jīng)保護作用[23]。

綜上可見，唐由之經(jīng)驗方組方藥物可能通過其有效組分直接命中多個OA靶標，其機制涉及促神經(jīng)細胞的生成及穩(wěn)態(tài)、胞間信號傳導、胞間運輸動力調(diào)控、抑制退行進程、抗氧化等神經(jīng)再生和神經(jīng)保護等。組方藥物間存在共享和獨有靶點，預示著可能存在藥物聯(lián)合應用的復雜機制或組方機制。在此，大數(shù)據(jù)分析為深入揭示方證、方病相關(guān)性帶來巨大潛力[24]，未來研究將基于網(wǎng)絡藥理學理論框架進一步解析該組方藥物有效組分靶點與OA疾病靶標之間的復雜關(guān)系，并進行生物學驗證，揭示其組方機制，指導臨床用藥(致謝：感謝唐由之教授對本研究的支持)

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