高久翔 于亮

北京體育大學(xué)（北京 100084）

FUN14 domain containing 1（FUNDC1）作為哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的線粒體受體蛋白，在低氧條件下已被證實能夠引起線粒體自噬。線粒體自噬對機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常代謝至關(guān)重要，可調(diào)節(jié)多種疾病狀態(tài)。運動作為一種應(yīng)激干預(yù)能夠激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMPK）并在絲氨酸317（Ser-317）位點磷酸化自噬啟動激酶UNC-51樣激酶-1（ULK1），引起骨骼肌的線粒體自噬。目前線粒體自噬的分子機制主要集中在酵母細(xì)胞中Atg家族蛋白、PTEN誘導(dǎo)激酶1（PINK1）—帕金森氏病蛋白2（Parkin）途徑、缺氧等應(yīng)激條件下、以及哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中Bcl-2家族成員Bnip3L/Nix介導(dǎo)的線粒體自噬等。而FUNDC1在運動誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體自噬中的作用尚未有明確報道，本文通過FUNDC1與AMPK通路的關(guān)系，針對其在運動誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體自噬過程中的作用進行綜述，為解釋這種新型線粒體自噬的受體蛋白FUNDC1在AMPK信號通路中的作用提供新的論證。

1 FUNDC1結(jié)構(gòu)

FUNDC1是哺乳動物細(xì)胞中的新型線粒體受體蛋白，包含155種氨基酸，是在缺氧條件下聚集的線粒體膜（mitochondrial-associated-membrane，MAM）蛋白，可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留（endopllasmic reticulum，ER）蛋白中的新型鈣聯(lián)接蛋白（calnexin，CANX）相互作用[1]。FUNDC1含有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，以及暴露于胞質(zhì)溶膠的N末端結(jié)構(gòu)域和插入線粒體外膜的C末端結(jié)構(gòu)域[2]。在胞質(zhì)溶膠暴露的N末端含有特征性LIR基序，通常CANX的N末端與MAM上的FUNDC1的親水結(jié)構(gòu)域相連，線粒體外膜蛋白FUNDC1與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein light chain，LC3）通過YxxL（LC3-Interacting Region，LIR）基序?qū)€粒體自噬產(chǎn)生影響[3]，隨著線粒體自噬進行，其從CANX解離并優(yōu)選募集動力相關(guān)蛋白1（dynamin，DNM1L/DRP1）以驅(qū)動響應(yīng)缺氧脅迫的線粒體分裂[1]。線粒體自噬受體FUNDC1不僅是新型MAM蛋白，并且是DNM1L的新的線粒體受體，促進線粒體碎裂和響應(yīng)缺氧造成的線粒體自噬。

2 應(yīng)激條件對FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬的作用

線粒體在應(yīng)激條件下會導(dǎo)致線粒體裂變或融合，線粒體應(yīng)激通過線粒體自噬和凋亡刺激破壞上述復(fù)合物，線粒體的裂變或融合以及線粒體自噬是構(gòu)成線粒體質(zhì)量控制的重要組成部分[4]。在線粒體應(yīng)激時，位于線粒體外膜的這些受體變?yōu)榱姿峄蛉チ姿峄?，以增強與LC3或其他自噬基因的相互作用，用于啟動線粒體自噬。BNIP3L/Nix[3]和FUNDC1[5]已經(jīng)被確定為哺乳動物細(xì)胞中的線粒體自噬受體，BNIP3作為促凋亡蛋白在因低氧導(dǎo)致的自噬和細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用[6]。另外，BNIP3或BNIP3L/Nix的過表達在一系列應(yīng)激下啟動保護性自噬，可能是由于破壞了BCL2/BCL-XL和酵母Atg6同系物Beclin1[7]之間的關(guān)聯(lián)所致，而FUNDC1則在低氧條件下引起線粒體自噬。在酵母細(xì)胞中的線粒體自噬受體Atg32[8]能夠與Atg11彼此間產(chǎn)生作用，但與線粒體自噬啟動的早期步驟形成的自噬體[9]有著明顯差別。

2.1 饑餓對FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控

通常自噬可能是在減少營養(yǎng)供應(yīng)或缺氧、高溫、活性氧（Reactive oxidative species，ROS）等其他應(yīng)激條件下激活以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。饑餓是自噬的最常見的觸發(fā)因素，通常饑餓可以分為氨基酸饑餓和糖饑餓，通過自傳感器監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)，當(dāng)缺少氨基酸或生長因子時可通過PI3K-mTOR途徑誘導(dǎo)自噬[10]。在酵母細(xì)胞中，Atg32作為特異性酵母線粒體自噬感受器在氮饑餓條件下磷酸化并增強與Atg11的作用，特異性地參與降解受損或多余的線粒體[11]。當(dāng)GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠分離的肝細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中時，自噬體大量吞噬線粒體[12]。AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]對運動能力及線粒體功能調(diào)控至關(guān)重要。在禁食過程中作為自噬的激活因子，AMPK可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）復(fù)合物并直接磷酸化FoxO3和ULK1。ULK1是因營養(yǎng)缺乏引發(fā)自噬的調(diào)節(jié)信號，在低糖情況下，AMPK通過磷酸化Ser-317和Ser-777直接激活ULK1促進自噬[13]。當(dāng)營養(yǎng)充足時，mTOR作用ULK1的Ser-757位點，影響ULK1與AMPK之間的作用，阻止ULK1激活[14]。通常情況下，機體自噬水平較低，間歇性禁食作為一種新型減脂手段，除了具有控制體重的作用外，還可以通過適度激活A(yù)MPK-ULK1通路促進骨骼肌自噬，清除受損的細(xì)胞器或代謝廢物，以維持骨骼肌質(zhì)量[15]，根據(jù)實驗結(jié)果推測其自噬連接蛋白同樣可能為FUNDC1。

2.2 缺氧對FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控

氧是線粒體氧化磷酸化的重要代謝底物。線粒體通過消耗大量氧進行氧化磷酸化，缺氧對血管生成、代謝改變、細(xì)胞增殖、化學(xué)抗性等有重要的影響[16]。在缺氧期間由于細(xì)胞色素c氧化酶在電子傳遞鏈過程中缺乏O2而不能運輸電子[2]導(dǎo)致線粒體和細(xì)胞的損傷，包括降低氧化磷酸化和細(xì)胞色素c氧化酶活性和增加ROS產(chǎn)生，在缺氧期間的這些損傷誘導(dǎo)了線粒體自噬。FUNDC1在缺氧的早期階段結(jié)合鈣聯(lián)接蛋白（calnexin，CANX），然后從CANX解離并優(yōu)先與DNM1L相互作用，而當(dāng)缺氧時間延長，兩種蛋白結(jié)合到FUNDC1的相同區(qū)域，在不同情況下競爭[1]?，F(xiàn)已證實缺氧可在體內(nèi)和體外觸發(fā)自噬。在常氧情況下，酪氨酸蛋白激酶SRC可通過位于LIR基序中的酪氨酸Tyr-18促使FUNDC1磷酸化，而FUNDC1在低氧導(dǎo)致的線粒體自噬之前通常會發(fā)生SRC激酶的失活而去磷酸化[5]，致使線粒體自噬激活。研究表明，去磷酸化的FUNDC1對LC3具有更高的親和力，從而增強FUNDC1-LC3相互作用和募集自噬機制以形成自噬體[10]。此外，F(xiàn)UNDC1還可以通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶CK2在絲氨酸13（Ser-13）[10]處磷酸化，其機制是Ser-13在常氧下被CK2磷酸化，并且由線粒體定位的磷酸甘油酸變位酶PGAM5響應(yīng)缺氧而去磷酸化，阻止和LC3之間的相互作用，影響隨后的線粒體自噬。缺氧則影響FUNDC1這種線粒體自噬受體的可逆磷酸化，激活線粒體自噬。

隨著缺氧時間的延長，線粒體膜蛋白如FUNDC1，TIMM23和TOMM20表達顯著減少，但FUNDC1的降解比其他線粒體蛋白（包括TIMM23和TOMM20）快得多，這種降解可被蛋白酶體抑制劑MG132或自噬抑制劑氯喹抑制[17]，說明還存在其他機制調(diào)控FUNDC1與線粒體自噬之間的關(guān)系。在線粒體動態(tài)機制中，線粒體定位的RING-finger E3連接酶膜相關(guān)環(huán)指蛋白5[membrane-associated ring finger（C3HC4） 5，MARCH5]，通過泛素化DNM1L或通過泛素化和降解裂變受體FIS1和MIEF2抑制線粒體DNM1L的移位來抑制線粒體裂變。MARCH5在線粒體形態(tài)和線粒體自噬中發(fā)揮作用，MARCH5作為一種位于線粒體外膜上的E3連接酶，其特異性誘導(dǎo)FUNDC1降解。低氧環(huán)境能夠引發(fā)MARCH5寡聚體的拆卸，同時促進了其與FUNDC1的相互作用，以響應(yīng)在線粒體自噬之前的初始線粒體損傷，其依賴賴氨酸119（K-119）對FUNDC1的泛素化，基于MARCH5的泛素化和降解的FUNDC1減少了突發(fā)和過量的線粒體自噬，從而保護細(xì)胞線粒體。然而，隨著缺氧時間的延長，F(xiàn)UNDC1殘基會發(fā)生去磷酸化[18]。

3 運動對FUNDC1的調(diào)節(jié)

3.1 運動與AMPK

運動不但可以使線粒體的功能加強，還能通過對線粒體自噬的調(diào)控，維持線粒體質(zhì)量和數(shù)量的穩(wěn)定，保證其良好的功能狀態(tài)。適宜運動有助于自噬能力增強，降解因運動刺激所產(chǎn)生的破損和衰老的細(xì)胞器以及合成或折疊錯誤的蛋白質(zhì)，抑制骨骼肌和心肌細(xì)胞凋亡或死亡[12，19]，但是過量運動則會導(dǎo)致骨骼肌和心肌細(xì)胞損傷、疲勞，甚者對免疫功能產(chǎn)生影響，誘發(fā)自噬性細(xì)胞死亡[20]。運動可以影響骨骼肌能量代謝，運動過程中當(dāng)AMP水平增高，ATP水平降低時，能量傳感器AMPK被激活[21]。AMPK能夠感受細(xì)胞內(nèi)能量變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以維持能量穩(wěn)態(tài)。有研究表明，作為能量代謝總開關(guān)，運動過程中的能量消耗主要導(dǎo)致AMPKα的激活。這不僅可以對骨骼肌體積及肌纖維類型進行調(diào)控，還可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)因子，使LC3-I轉(zhuǎn)化為LC3-II并減少自噬選擇性底物p62的含量激活自噬，進而改變骨骼肌蛋白質(zhì)降解水平[22]。

3.2 AMPK與ULK

AMPK不但可以磷酸化TSC2[23]和Raptor[24]，降低mTORC1的活性，還可以在Ser-317位點磷酸化自噬啟動激酶ULK1，通過磷酸化ULK1、PI3K復(fù)合體促進自噬[14]。ULK1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在酵母細(xì)胞中的同源物是 Atg1，Atg1和 Atg11、Atg13、Atg17、Atg29及Atg31形成復(fù)合體[25，26]，Atg1或者ULK1復(fù)合體都受到TOR或者mTORC1信號通路的調(diào)控。ULK1可通過兩條途徑實現(xiàn)其在自噬中的功能，一是通過激酶活性磷酸化其他蛋白，二是不依賴其激酶活性招募其他Atg蛋白。在酵母細(xì)胞中，TOR能通過磷酸化Atg1及Atg13破壞二者間的作用使自噬水平降低[25]。而在晡乳動物中，雖然mTORC1依然能磷酸化ULK1及mAtg13，但是并不破壞兩者間的相互作用。哺乳動物因不存在Atg11、Atg17，Atg29及Atg31基因，可能存在其它蛋白對自噬進行調(diào)控。

3.3 ULK與FUNDC1

運動可以導(dǎo)致線粒體受損、能量代謝改變，使細(xì)胞能量降低從而激活A(yù)MPK，促進自噬發(fā)生。為保持線粒體的穩(wěn)定，AMPK磷酸化ULK1對受損傷的線粒體進行選擇性的清除，即線粒體自噬[27]。FUNDC1通過增強與LC3之間的結(jié)合能力，成為ULK1在選擇性線粒體自噬中的新連接蛋白。通過缺氧或FCCP的刺激誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生后，ULK1的表達水平與FUNDC1的磷酸化相關(guān)。Ser-17和Tyr-18是兩個相鄰位點，F(xiàn)UNDC1通過ULK1的Ser-17磷酸化激活，Ser-17的磷酸化促進線粒體自噬。然而Tyr-18磷酸化對于線粒體自噬起抑制作用，在缺氧條件下通過SRC激酶抑制ULK1與線粒體自噬的結(jié)合位點，即在LIR基序中通過對Tyr-18的磷酸化使FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬受到影響，并通過ULK1降低Ser-17的FUNDC1的磷酸化[28]?？梢娋€粒體自噬所必需的ULK1和FUNDC1是通過它們之間的協(xié)同作用調(diào)節(jié)線粒體自噬的，而運動是否通過啟動AMPK磷酸化ULK1調(diào)節(jié)FUNDC1，仍需要深入研究才能得出結(jié)論。

4 FUNDC1在運動誘導(dǎo)線粒體自噬中的作用

線粒體作為ATP的來源，是機體生命活動的重要結(jié)構(gòu)，運動特別是離心運動可以導(dǎo)致骨骼肌線粒體在肌膜下聚積，呈現(xiàn)大小不一，肌纖維內(nèi)線粒體出現(xiàn)腫脹、嵴稀少，呈空泡化等嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常。為了防止線粒體損傷，細(xì)胞可以通過啟動保持線粒體健康的質(zhì)量控制機制即線粒體自噬，在細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞死亡中起著重要作用，是正常的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能的基礎(chǔ)，也是運動發(fā)揮健康效應(yīng)的機制之一。研究證明在哺乳動物細(xì)胞中線粒體的調(diào)節(jié)可以分為兩種途徑：第一種機制依賴于絲氨酸/蘇氨酸激酶PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）和一種E3泛素蛋白連接酶帕金森氏病蛋白2（Parkinson protein 2，Parkin）[29]，其次依賴于線粒體外界的受體蛋白[30]。

4.1 運動介導(dǎo)的線粒體PINK1-Parkin自噬通路

到目前為止，已知在哺乳動物細(xì)胞中可以通過PINK1-Parkin途徑介導(dǎo)線粒體自噬[16]，PINK1、Parkin可以通過調(diào)控線粒體質(zhì)量的動態(tài)變化以及影響線粒體運動這兩種方式進行調(diào)節(jié)。當(dāng)線粒體膜電位丟失時，線粒體功能喪失信號，作為E3泛素連接酶的Parkin，PINK1-PARK2/Parkin通路在誘導(dǎo)線粒體自噬中起到重要作用[31]。內(nèi)源性或異位表達的Parkin可以通過PINK1的相互作用被募集到去極化的線粒體[32]，但缺氧不會誘導(dǎo)Parkin轉(zhuǎn)移到線粒體[17]。PINK1可以在Ser-65磷酸化Parkin，這是Parkin易位和隨后的線粒體自噬的先決條件[33]，易位的PARK2泛素化許多線粒體外膜蛋白，以募集p62或與LC3相互作用的其他分子用于自噬體形成[34]，其后通過自噬機制將SQSTM1/p62轉(zhuǎn)位至線粒體并吞噬片段化的線粒體或一部分線粒體，而Parkin突變體阻礙了線粒體質(zhì)量控制，是帕金森病的產(chǎn)生原因。然而Jamart等[35]通過對8名超耐力運動員在一次24 h跑臺運動實驗后，發(fā)現(xiàn)骨骼肌PINK1、Parkin蛋白表達并未發(fā)生明顯改變，而6周耐力訓(xùn)練可以使小鼠骨骼肌PINK1、Parkin中mRNA表達上調(diào)[36]，可見在運動誘導(dǎo)的線粒體自噬中PINK1/Parkin的作用可能為耐力訓(xùn)練引發(fā)線粒體自噬的敏感信號通路。

此外，活化的PINK1磷酸化Parkin，并泛素化線粒體外膜蛋白，包括線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）、線粒體融合蛋白（mitofusin 1，Mfn1）和線粒體融合蛋白（mitofusin 2，Mfn2）、以及招募自噬受體如視神經(jīng)蛋白（optiueurin，OPTN）和卷曲螺旋蛋白 52（nuclear dot protein 52，NDP52）來調(diào)節(jié)線粒體的吞噬[37，38]。

4.2 運動介導(dǎo)的線粒體自噬與受體蛋白之間的關(guān)系

目前已經(jīng)證實幾種線粒體受體可以選擇性地介導(dǎo)線粒體自噬，如ATG32是酵母中首次報道的線粒體自噬受體，介導(dǎo)ATG8的聚集使LC3在同系物中存在，吞噬受損線粒體的囊泡[39-41]。此外，一些核心自噬組件也在線粒體自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，比如不存在Atg7或ULK1的情況下，網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的線粒體清除就會減少[42]。在哺乳動物中，通過自噬的NIX（也稱BNIP3L）依賴性方式消除線粒體是紅細(xì)胞成熟的關(guān)鍵[43]，以達到選擇性清除線粒體的作用。在紅細(xì)胞成熟期間，BNIP3L/NIX及其同源物BNIP3與LC3之間的作用介導(dǎo)線粒體自噬，哺乳動物細(xì)胞中線粒體自噬的另一介體BCL2L13/BCL-RAMBO的活性受誘導(dǎo)或磷酸化的調(diào)節(jié)[44]。低氧條件下的線粒體自噬可以通過低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）促進BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬保護機制，有效清除因低氧聯(lián)合運動所損傷的線粒體，提高骨骼肌線粒體的結(jié)構(gòu)功能[45]。

4.3 運動與FUNDC1之間的潛在關(guān)系

與其他自噬LC3受體蛋白有所差別，線粒體受體FUNDC1結(jié)合LC3和誘導(dǎo)線粒體自噬的能力受磷酸化負(fù)調(diào)控[16]。當(dāng)?shù)脱趸蛘呔€粒體膜電勢下降時，PGAM5作為線粒體表面膜蛋白FUNDC1的磷酸酶通過與FUNDC1的結(jié)合，降低FUNDC1 Ser13的磷酸化水平，Ser-13的去磷酸化可以增加FUNDC1與LC3之間的結(jié)合，并且降低PGAM5表達水平后可以有效地防止缺氧條件下在Ser-13處的FUNDC1的去磷酸化和線粒體蛋白的降解[46]，同時Tyr18也發(fā)生脫磷酸化，募集LC3和自噬膜泡包裹的線粒體，促進線粒體自噬。在哺乳動物中CK2能夠磷酸化p62，調(diào)控選擇性自噬，通過CK2抑制劑TBBt處理的HeLa細(xì)胞Ser-13處的FUNDC1磷酸化水平降低，說明CK2能磷酸化FUNDC1 Ser-13[47]。而酪氨酸蛋白激酶能通過磷酸化FUNDC1 Tyr-18，導(dǎo)致FUNDC1與LC3之間的關(guān)聯(lián)減弱以及線粒體的自噬。并且，F(xiàn)UNDC1表現(xiàn)出的泛素化在暴露于缺氧的細(xì)胞中以時間依賴性方式顯著增強。但關(guān)于Parkin是否介導(dǎo)FUNDC1泛素化和降解的研究發(fā)現(xiàn)，與FCCP治療不同，缺氧不誘導(dǎo)GFP-Parkin轉(zhuǎn)移到線粒體。Parkin的過表達未能增強HeLa細(xì)胞中的FUNDC1泛素化或降解[18]，表明在缺氧處理后，F(xiàn)UNDC1可以以非依賴Parkin的方式進行泛素化介導(dǎo)的降解。

運動導(dǎo)致線粒體受到損傷或破壞時，細(xì)胞能量降低激活A(yù)MPK，從而促進自噬，作為線粒體自噬所必需的ULK1和FUNDC1可以協(xié)同調(diào)節(jié)線粒體自噬，F(xiàn)UNDC1將ULK1募集到損傷的線粒體，其中ULK1的FUNDC1磷酸化對線粒體自噬起到?jīng)Q定性作用，ULK1與FUNDC1相互作用，使其在絲氨酸17處磷酸化，加強FUNDC1與LC3的結(jié)合，F(xiàn)UNDC1的ULK1結(jié)合缺陷突變體阻止ULK1轉(zhuǎn)位到線粒體并對線粒體自噬產(chǎn)生影響[31]。此外，F(xiàn)UNDC1還可以依賴Atg5介導(dǎo)線粒體自噬，通過去表達Atg5發(fā)現(xiàn)可以阻斷從LC3-I到LC3-II的變化并減少由FUNDC1介導(dǎo)的線粒體內(nèi)膜蛋白TIM23，去表達BECN1也可以抑制雷帕霉素和饑餓誘導(dǎo)的自噬[48，49]，然而BECN1的去表達沒有阻止FUNDC1誘導(dǎo)的線粒體自噬[50]。

5 小結(jié)

骨骼肌和線粒體分別作為運動時的動力來源和能量產(chǎn)生的工廠，為機體代謝的調(diào)控以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起到重要作用。目前對骨骼肌線粒體自噬的了解程度還處于較低水準(zhǔn)，作為新發(fā)現(xiàn)的線粒體自噬受體蛋白，F(xiàn)UNDC1因在缺氧條件下發(fā)揮其重要作用而越來越受到關(guān)注，但目前對于FUNDC1在運動誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體自噬中作用的研究仍不充分。運動誘導(dǎo)的骨骼肌線粒體自噬可能通過AMPK-ULK1信號通路影響FUNDC1表達，今后有關(guān)骨骼肌線粒體自噬的研究可注重FUNDC1與能量代謝之間的關(guān)系，從而為探究運動能否通過線粒體自噬途徑對機體的疾病治療起到輔助作用提供依據(jù)。