陳麗竹，盧金淼，郁穎佳，段更利，李智平（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海201102）

小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物水解方法及促進(jìn)酶解反應(yīng)方法的研究進(jìn)展Δ

陳麗竹＊，盧金淼，郁穎佳，段更利，李智平#（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海201102）

目的：為小分子藥物Ⅱ相代謝過(guò)程研究及相關(guān)分析提供參考。方法：查閱近幾年相關(guān)研究文獻(xiàn)，歸納小分子藥物Ⅱ相代謝常見(jiàn)結(jié)合反應(yīng)的類(lèi)型并總結(jié)其代謝綴合物水解方法及促進(jìn)酶解反應(yīng)方法的研究進(jìn)展。結(jié)果與結(jié)論：Ⅱ相代謝是Ⅰ相代謝物在體內(nèi)的結(jié)合反應(yīng)，包括糖苷結(jié)合、硫酸化、甲基化、乙?；?、氨基酸結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、縮合反應(yīng)等。其中，最常見(jiàn)的小分子藥物Ⅱ相代謝反應(yīng)是與葡萄糖醛酸結(jié)合或與硫酸結(jié)合，生成葡萄糖醛酸苷綴合物或硫酸酯綴合物。小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物常見(jiàn)的水解方法包括酸水解、堿水解和酶水解。其中，酶水解以其安全、溫和、不會(huì)引起目標(biāo)物分解、重復(fù)性好、藥物回收率高等優(yōu)點(diǎn)，成為目前使用最廣泛的水解方法。促進(jìn)酶解反應(yīng)的方法目前主要有紅外輻射法和超聲波法，兩種方法都對(duì)不同的酶系反應(yīng)有促進(jìn)作用。

小分子藥物；Ⅱ相代謝綴合物；水解方法；酶解反應(yīng)；紅外輻射法；超聲波法

藥物在體內(nèi)需要經(jīng)歷吸收、分布、代謝、排泄的過(guò)程。藥物的代謝又稱(chēng)為藥物的生物轉(zhuǎn)化，是指藥物在體內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收、分布之后，在酶的作用下經(jīng)歷化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的過(guò)程。目前，該領(lǐng)域研究范圍較廣，包括：代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性研究、新代謝方法的研究、藥物代謝酶的研究、代謝選擇性的研究、藥物代謝的影響因素研究，等等。一般來(lái)說(shuō)，藥物進(jìn)入體內(nèi)后都要發(fā)生各種酶的催化下的化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)可以最大程度地減少外源性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的不良影響，是生物體長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。對(duì)藥物的代謝及代謝物的研究有助于了解藥物在體內(nèi)的變化情況，闡明藥物的有效性、毒性及作用機(jī)制。

藥物代謝分為Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相反應(yīng)[1-4]。Ⅰ相反應(yīng)包括氧化、還原和水解等反應(yīng)。Ⅱ相反應(yīng)也稱(chēng)為結(jié)合反應(yīng)，包括糖苷結(jié)合、硫酸化、甲基化、乙酰化、氨基酸結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、縮合反應(yīng)等。小分子藥物經(jīng)過(guò)Ⅰ相反應(yīng)后，分子結(jié)構(gòu)中增加了羥基、羧基等極性基團(tuán)，使其水溶性增加，易于從泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中排泄。同時(shí)，這些Ⅰ相代謝物還能夠與體內(nèi)的一些內(nèi)源性化合物結(jié)合發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)，生成極性更大的新的代謝物從尿液中排出體外。這些內(nèi)源性化合物主要有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸和乙酰輔酶A等。其中，與葡萄糖醛酸或硫酸的結(jié)合反應(yīng)最為常見(jiàn)，生成葡萄糖醛酸苷綴合物或硫酸酯綴合物。藥理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、代謝組學(xué)等研究工作都需要對(duì)藥物Ⅱ相代謝綴合物進(jìn)行分析。但是，藥物Ⅱ相代謝綴合物因?yàn)槌煞謴?fù)雜且極性大不易被有機(jī)溶劑提取，故需要先對(duì)這些綴合物進(jìn)行水解，以便藥物釋放出來(lái)，從而進(jìn)行后續(xù)處理與分析。筆者查閱近幾年相關(guān)研究文獻(xiàn)，總結(jié)了小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物水解方法及促進(jìn)酶解反應(yīng)方法的研究進(jìn)展，旨在為小分子藥物Ⅱ相代謝過(guò)程研究及相關(guān)分析提供參考。

1 小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物水解方法

常見(jiàn)的水解方法有酸水解、堿水解和酶水解。

酸水解通常使用高氯酸、鹽酸或三氯乙酸等進(jìn)行水解。李偉紅、顏流水、吳永寧等[5-7]就分別用以上3種不同的酸進(jìn)行了Ⅱ相代謝綴合物的水解。

堿水解常用氫氧化鈉（NaOH）溶液或堿性緩沖液進(jìn)行水解。張雪曼等[8]在測(cè)定動(dòng)物尿液中克倫特羅和沙丁胺醇時(shí)，就先用0.5 mol/L NaOH溶液進(jìn)行了前處理。

酶水解常使用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶在pH 4.6～5.2的乙酸銨緩沖溶液中進(jìn)行水解，水解時(shí)間為2～24 h不等，溫度控制在37℃左右。王鳳美、曾少東、李陽(yáng)、王國(guó)民等[9-12]就分別利用酶水解法處理了動(dòng)物食品、尿液、肉制品、血液中的β受體激動(dòng)藥Ⅱ相代謝綴合物殘留。其中，李陽(yáng)等[11]還比較了采用酶水解與不采用酶水解的情況下藥物的提取率，發(fā)現(xiàn)采用酶水解后藥物的提取率顯著增加。

通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和總結(jié)發(fā)現(xiàn)，酸水解和堿水解的優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)便、快速、成本低廉，并能減少酶水解過(guò)程中酶制劑和其樣品水解后產(chǎn)生的蛋白類(lèi)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的干擾；缺點(diǎn)是：水解反應(yīng)較劇烈，可能會(huì)造成某些目標(biāo)物的分解。酶水解的優(yōu)點(diǎn)是：安全、條件比較溫和，不會(huì)引起目標(biāo)物分解，且重復(fù)性好，藥物回收率高；缺點(diǎn)是：使用成本較高，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，且酶水解過(guò)程中酶制劑和其樣品水解后產(chǎn)生的蛋白類(lèi)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物可能產(chǎn)生干擾。從目前的文獻(xiàn)報(bào)道中可知，因酶水解具備酸水解和堿水解所不具備的諸多優(yōu)點(diǎn)，故實(shí)際工作中最為常用。

2 促進(jìn)酶解反應(yīng)方法

酶水解因具有多種優(yōu)點(diǎn)而在小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物研究中得到廣泛的使用，但是酶解反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般為2～24 h，而這增加了整個(gè)研究工作的時(shí)間，并有可能會(huì)導(dǎo)致部分生物樣品變質(zhì)，給相關(guān)研究帶來(lái)不便。因此，加快酶解反應(yīng)的速率對(duì)于縮短整個(gè)酶水解過(guò)程耗費(fèi)的時(shí)間是有必要的。酶解反應(yīng)相對(duì)其他水解反應(yīng)來(lái)說(shuō)具有較嚴(yán)格的溫度控制要求，所以升溫等常規(guī)加速反應(yīng)的方法不適用，必須考慮在反應(yīng)過(guò)程中增加其他能量源。目前用于促進(jìn)酶解反應(yīng)的方法主要有紅外輻射法和超聲波法。

2.1 紅外輻射法

紅外輻射是介于可見(jiàn)光與微波之間的電磁波，其波長(zhǎng)范圍在約0.76～1 000 μm之間。傳統(tǒng)上把紅外光分為3個(gè)區(qū)域：波長(zhǎng)為0.76～1.44 μm的紅外光稱(chēng)作近紅外光；波長(zhǎng)為1.44～3.00 μm的紅外光稱(chēng)作中紅外光；波長(zhǎng)為3.00～1 000 μm的紅外光稱(chēng)作遠(yuǎn)紅外光[13-14]。紅外輻射相比較其他的能量源來(lái)說(shuō)具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：（1）安全環(huán)保。與微波相比，紅外輻射對(duì)人體的危害極小，無(wú)需考慮泄露的問(wèn)題。波長(zhǎng)為8～14 μm的紅外光更是生物生存必不可少的因素，被稱(chēng)為“生命光波”。（2）節(jié)能高效。紅外輻射熱量是以電磁波形式傳遞的，不需要任何媒介，同時(shí)也不會(huì)產(chǎn)生任何廢棄物污染周?chē)h(huán)境。同時(shí)，生物物料對(duì)紅外光的吸收率較高。（3）節(jié)省成本。與微波等其他裝置相比，紅外輻射裝置價(jià)格低廉，易于推廣。

紅外輻射促進(jìn)酶解反應(yīng)的機(jī)制在于大多數(shù)活性化合物和提取溶劑（水、有機(jī)溶劑）的吸收光譜均在2.5～25 μm之間，處于紅外輻射的范圍內(nèi)，因此紅外輻射可到達(dá)物料內(nèi)部，使基質(zhì)內(nèi)部溫度上升，增加各個(gè)有效成分在介質(zhì)中的溶解度，同時(shí)加速反應(yīng)終產(chǎn)物向溶劑的擴(kuò)散，從而縮短反應(yīng)時(shí)間，提高效率[15-18]。

Silveira PC等[19-20]對(duì)大鼠經(jīng)過(guò)潰瘍和創(chuàng)傷后的細(xì)胞色素氧化酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在紅外光（0.904 μm）作用下，細(xì)胞色素氧化酶活性增加。Hu WP等[21]研究發(fā)現(xiàn)近紅外光的照射能夠使細(xì)胞色素氧化酶的氧化速率提高1倍。Yu W等[22]也報(bào)道在紅外光的照射下細(xì)胞色素氧化酶的氧化速率提高了80%。有研究者利用紅外光頻率與蛋白質(zhì)分子、胰蛋白酶分子運(yùn)動(dòng)頻率相一致的原理，可引起蛋白質(zhì)分子骨架結(jié)構(gòu)的共振效應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子處于高能狀態(tài)，同時(shí)增加胰蛋白酶分子的活性，從而加速了蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)，將蛋白質(zhì)酶解時(shí)間從傳統(tǒng)水浴酶解時(shí)間10 h左右縮短到幾分鐘[23-24]。另有研究者研制了一個(gè)溫度可控的紅外輻射系統(tǒng)，以期在一個(gè)相對(duì)恒定的溫度下運(yùn)用紅外輻射加速酶解反應(yīng)，并通過(guò)模型樣品蛇床子的酶解反應(yīng)過(guò)程對(duì)該系統(tǒng)的可行性和性能進(jìn)行了論證。在該試驗(yàn)中，采用紅外輔助提取所得蛇床子素和歐前胡素的提取率統(tǒng)計(jì)學(xué)上均顯著高于采用超聲輔助提取所得的提取率（P＜0.05），酶解反應(yīng)時(shí)間由傳統(tǒng)水浴酶解的1 h大幅縮短到了2 min[25]。

2.2 超聲波法

超聲波是指頻率大于19.2 kHz的聲波，具有波動(dòng)與能量雙重屬性，是一種均勻的球面機(jī)械波，可在液體內(nèi)部產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波和微射流，使出現(xiàn)局部高溫、高壓，導(dǎo)致諸多次級(jí)效應(yīng)，如擊碎、乳化、擴(kuò)散、強(qiáng)烈的機(jī)械振蕩等，從而可加速體系的傳質(zhì)、傳熱等過(guò)程。當(dāng)超聲波振動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量，使起媒質(zhì)質(zhì)點(diǎn)以極高的速度和加速度進(jìn)入振動(dòng)狀態(tài)，媒質(zhì)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，促使有效成分進(jìn)入溶劑中。當(dāng)振動(dòng)處于稀疏狀態(tài)時(shí)，液體會(huì)被撕裂成很多的小空穴，這些小空穴瞬間閉合會(huì)產(chǎn)生高達(dá)幾千大氣壓的瞬時(shí)壓力，即空化現(xiàn)象。這種空化現(xiàn)象有利于提高目標(biāo)物提取率[26-27]。

一定條件下，超聲波可以促進(jìn)不同酶解反應(yīng)體系中的酶解速率加快，從而縮短酶解反應(yīng)時(shí)間。Adewale P等[28]研究了超聲波的不同功率對(duì)酶促酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的影響，得到了促進(jìn)該反應(yīng)的最佳超聲振幅；Badgujar KC等[29]研究表明超聲波能夠提高生物催化中脂肪酶的活性，從而促進(jìn)酶解反應(yīng)；BasharI M等[30]研究表明超聲波可以促進(jìn)葡聚糖酶對(duì)葡萄糖聚合物的降解作用；Subhedar PB等[31]研究證實(shí)了低強(qiáng)度的超聲波提高了細(xì)胞中纖維素酶的活性，從而促進(jìn)了酶解速率加快。

以上研究表明，超聲時(shí)間、溫度、功率、頻率等條件均對(duì)超聲波對(duì)于酶解反應(yīng)的促進(jìn)作用有影響。但超聲參數(shù)選擇不合適，反而可能會(huì)抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，要達(dá)到促進(jìn)酶解反應(yīng)的目的，必須根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)某晽l件。

3 結(jié)語(yǔ)

研究藥物的代謝，對(duì)新藥研發(fā)、制劑工藝優(yōu)化和臨床安全用藥都具有重要指導(dǎo)意義。藥物在體內(nèi)的代謝反應(yīng)尤其是Ⅱ相代謝復(fù)雜且多變，從而導(dǎo)致了藥物在體內(nèi)存在的形式不同，又由于體內(nèi)介質(zhì)組成繁雜、待測(cè)藥物濃度偏低等原因，樣品的前處理一直是體內(nèi)藥物分析的重點(diǎn)及難點(diǎn)，因此有必要找到合適且便捷的前處理方法為藥物的測(cè)定創(chuàng)造良好的條件。水解是小分子藥物Ⅱ相代謝綴合物前處理的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而酶水解是最為常用的一種水解方法。在合適的條件下，紅外輻射法和超聲波法均能提高酶的活性從而加快酶解反應(yīng)的速率，縮短酶解反應(yīng)時(shí)間。其機(jī)制目前并未完全明確，仍需進(jìn)一步的研究揭示。

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A

1001-0408（2017）27-3886-03

2017-05-19

2017-08-19）

（編輯：周 箐）

上海市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2016ZB0305）

＊博士研究生。研究方向：藥物分析和藥動(dòng)學(xué)。E-mail：lzchen2016@126.com

#通信作者：主任藥師，教授，博士。研究方向：兒科臨床藥理學(xué)。E-mail：zplifudan@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.40