賈小婷 羅利云 李 楠 (廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

高表達的Wnt分泌蛋白1促進肺癌化療耐受

賈小婷 羅利云 李 楠 (廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

目的探討Wnt分泌蛋白(WISP)1在肺癌中的表達量及作用。方法生物信息學分析WISP1在肺癌及癌旁組織中的表達量，qRT-PCR檢測肺癌組織及癌旁組織中WISP1 mRNA的表達。在肺癌細胞中干預WISP1的表達，檢測處理后細胞化療敏感性的變化。結果生物信息學分析免疫組化數(shù)據(jù)庫聯(lián)合qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)，WISP1 mRNA在肺癌中的表達量顯著高于癌旁組織，且WISP1在肺癌化療耐受組的表達量顯著高于化療敏感組。在肺癌細胞中敲低WISP1對化療藥物奧沙利鉑的敏感性增加，反之亦然。結論WISP1在肺癌中高表達且促進肺癌化療耐受。

Wnt分泌蛋白1；肺癌；化療敏感性

肺癌治療耐受機制不清楚，是其死亡率居高不下的主要原因〔1，2〕。Wnt分泌蛋白(WISP)1是結締組織生長因子(CCN)家族的生長因子，能夠被Wnt-1和β-cantenin誘導轉錄〔3〕；其在整個胚胎發(fā)育過程中都有表達，而且參與傷口愈合及組織修復〔4〕。WISP1異常表達與多種疾病(如骨關節(jié)病變、纖維化及腫瘤等)密切相關〔5〕。本文旨在探討WISP1對肺癌化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 人正常肺上皮細胞BEAS-2B及肺癌細胞H1650、H460、A549、95D、HCC827、H1975和H1299由本實驗室保存。將上述細胞接種于含10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實驗標本均來自本院組織標本庫。收集未經(jīng)過化療或放療處理的肺癌組織標本55例，其中化療敏感組21例，化療耐受組34例，同時收集肺癌患者癌旁組織標本38例。

1.2RNAs提取及逆轉錄 購買Omega公司生產的RNA Isolation Kit I試劑盒提取組織及細胞總RNAs。從液氮中取出30 mg組織放入預冷的研缽中，加入液氮磨碎組織。加入700 μl RTK裂解液(事先已加入β-巰基乙醇)，用1 ml注射器來回吹打液體10次，加入700 μl無水乙醇，輕微顛倒混勻，12 000 r/min，4℃離心15 min。上清上柱，10 000 r/min離心1 min。棄去廢液，用500 μl RW1洗滌柱子1次，10 000 r/min離心1 min。棄去廢液，用700 μl RW2洗滌柱子2次。空甩，12 000 r/min，3 min。用30 μl無核酶水溶解RNA，靜置2 min。12 000 r/min離心2 min，獲得RNA樣品，用于后續(xù)逆轉錄。將目標細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，棄廢液，加入700 μl RTK裂解液(事先已加入β-巰基乙醇)，后續(xù)操作與組織提取RNA一致。購買Fermentas cDNA First Strand Reversing kit進行逆轉錄。配置逆轉錄體系：RNA 2 μg，oligo d(T)1 μl，水補足12 μl。65℃ 5 min，立即冰置2 min。加入4 μl反應緩沖物，1 μl RNA酶抑制劑，2 μl dNTP，1 μl 反轉錄酶。42℃ 1 h，70℃ 5 min。-20℃保存cDNA。

1.3qRT-PCR 反應：qRT-PCR購自Fermentas公司 SYBR Master Mix試劑盒，檢測體系：SYBR 10 μl，正向引物0.8 μl，反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，用水補足20 μl體系。在BioRad熒光定量PCR儀上50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s共40個循環(huán)。

根據(jù)2-ΔΔct值計算相對表達量。引物序列：GAPDH-正向5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3′，GAPDH-反向5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3′；WISP1-正向5′-GATGCCTGTGCCACTGACGT-3′，WISP1-反向5′-GTTAGTCCCCAAGACCCA-AGATTT-3′。

1.4載體構建 使用軟件Primer Premier 5設計引物，擴增WISP1開放閱讀框。上游引物：5′-ATAggatccATGGCTGTGAGTGCTGTAAGAT-3′；下游引物：5′-TATctcgagCTAGTTGGCAATT-TCTGAGAAGTC-3′，其中小寫字母表示限制性內切酶位點。用BamHI和XhoI消化PCR產物和pCMV-Flag載體，再用T4連接酶將酶切后的WISP1片段和載體連接起來，轉化，測序鑒定陽性克隆并命名為pCMV-WISP1。

1.5Western印跡 RIPA溫和裂解液(購自碧云天)裂解目標細胞，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。40 mg每孔蛋白的上樣量將目標蛋白置于點樣孔，待電泳結束，將其轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%牛奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜(抗β-actin，1∶500；抗WISP1，1∶1 000)，耦聯(lián)的辣根過氧化酶(HRP)二抗孵育2 h，化學增強發(fā)光法(ECL)染色發(fā)光。在正常肺上皮細胞中轉染質粒pCMV-WISP1，在肺癌細胞H1975中轉染靶向WISP1的siRNAs(購自廣州銳博生物有限公司)，48 h后Western印跡檢測WISP1表達量。

1.6細胞活力測定(MTS)實驗 以4 000個細胞/孔的密度接種目標細胞于96孔板，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。每組細胞分別加入0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L的奧沙利鉑(oxaliplatin)，每個實驗組設5個副孔。72 h后，加入20 μl/孔MTS，3 h后490 nm測量各孔的絕對吸光值。統(tǒng)計分析各組細胞的存活率。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計學分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進行t檢驗。

2 結 果

2.1WISP1 mRNA在肺癌中的表達 WISP1 mRNA在肺癌組織中的表達量(6.43±2.29)顯著高于癌旁組織(2.40±0.89，P=0.000)。在肺癌細胞H1650、H460、950、A549、HCC827、H1299、H1975中的表達量(1.36±0.08，1.99±0.06，2.74±0.23，2.96±0.06，3.58±0.19，5.19±0.15，24.92±4.19)顯著高于肺上皮細胞BEAS-2B(1.00±0.00；P=0.027，0.002，0.009，0.000，0.003，0.001，0.015)。

2.2WISP1與肺癌化療敏感性的關系 WISP1在化療耐受組的表達量(7.17±2.40)顯著高于化療敏感組(5.24±1.47，P=0.002)。在BEAS-2B細胞中過表達WISP1，MTS結果顯示W(wǎng)ISP1可明顯增加BEAS-2B細胞對化療藥物oxaliplatin的耐受性。采用siRNAs(購自廣州銳博生物有限公司)沉默WISP1，Western印跡結果顯示si-#3沉默效果最佳，用于后續(xù)研究。MTS結果顯示敲低WISP1可顯著提高H1975細胞對奧沙利鉑的敏感性。見圖1。

3 討 論

目前關于WISP1在腫瘤中的作用尚未有定論。有學者發(fā)現(xiàn)WISP1在乳腺癌中扮演抑癌基因，WISP1在淋巴結轉移組中的表達量低于淋巴結未轉移組，在預后差組的表達量低于預后良好組的表達量〔6〕。但有研究發(fā)現(xiàn)WISP1發(fā)揮原癌分子效應。WISP1在多種腫瘤中過表達，可促進腫瘤的發(fā)展進程，與患者預后負相關〔7〕。在用人前列腺癌細胞建立的異種移植小鼠模型中，用WISP1中和抗體處理能夠顯著抑制瘤體生長和骨轉移〔8〕。使用WISP1中和抗體缺失WISP1后能夠引起放療耐受的食管癌細胞有絲分裂障礙，但是對正常的食管癌細胞無影響〔8〕。WISP1可上調基質金屬蛋白酶(MMP)-2，促進黏著斑激酶(FAK)、細胞外信號調節(jié)激酶(MEK)及細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)發(fā)生磷酸化，促進細胞發(fā)生侵襲轉移〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)WISP1在肺癌組織高表達，且與肺癌化療耐受正相關。在肺癌細胞中敲低WISP1將增加該細胞的化療敏感性。

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015；65(2)：87-108.

2Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016〔J〕.CA Cancer J Clin，2016；66(1)：7-30.

3Xu L，Corcoran RB，Welsh JW，etal.WISP-1 is a Wnt-1-and beta-catenin-responsive oncogene〔J〕.Genes Dev，2000；14(5)：585-95.

4Berschneider B,K?nigshoff M.WNT1 inducible signaling pathway protein1 (WISP1)：a novel mediator linking development and disease〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2011；43(3)：306-9.

5Gurbuz I,Chiquet-Ehrismann R.CCN4/WISP1 (WNT1 inducible signaling pathway protein 1)：a focus on its role in cancer〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2015；62(2)：142-6.

6Davies SR，Watkins G，Mansel RE，etal.Differential expression and prognostic implications of the CCN family members WISP-1，WISP-2，and WISP-3 in human breast cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2007；14(6)：1909-18.

7Ono M，Inkson CA，Sonn R，etal.WISP1/CCN4：a potential target for inhibiting prostate cancer growth and spread to bone〔J〕.PLoS One，2013；8(8)：e71709.

8Li WF，Zhang L，Li HY，etal.WISP-1 contributes to fractionated irradiation-induced radioresistance in esophageal carcinoma cell lines and mice〔J〕.PLoS One，2014；9(4)：e94751.

9Hou CH，Chiang YC，F(xiàn)ong YC，etal.WISP-1 increases MMP-2 expression and cell motility in human chondrosarcoma cells〔J〕.Biochem Pharmacol，2011；81(11)：1286-95.

R734.2

A

1005-9202(2017)24-6025-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.009

國家自然科學基金項目(81602016，81472184)；廣州市衛(wèi)計委一般引導項目(20171A011321)；廣東省醫(yī)學科學技術研究基金(A2017362)

李 楠(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤化療耐受機制研究。

賈小婷(1985-)，女，實驗師，主要從事腫瘤化療耐受機制研究。

〔2017-05-23修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)