李曉娜 任海林 陳國(guó)俊 李 寧 侯 智 索吉明

(青海省人民醫(yī)院分子病理實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007)

低氧對(duì)前列腺間質(zhì)細(xì)胞活性氧、低氧誘導(dǎo)因子-1α、雄激素受體表達(dá)的影響及依達(dá)拉奉的干預(yù)作用

李曉娜 任海林1陳國(guó)俊1李 寧1侯 智1索吉明1

(青海省人民醫(yī)院分子病理實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007)

目的探討低氧環(huán)境下活性氧(ROS)在前列腺增生中的作用及依達(dá)拉奉對(duì)其的干預(yù)作用。方法流式細(xì)胞儀檢測(cè)前列腺增生組織及原代培養(yǎng)細(xì)胞中ROS的表達(dá)，低氧條件下觀察前列腺間質(zhì)細(xì)胞ROS及生長(zhǎng)變化，熒光定量PCR法檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、雄激素受體(AR)的變化。低氧條件下用依達(dá)拉奉干預(yù)后，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)及ROS、HIF-1α、AR的變化。結(jié)果前列腺增生組織及3%O2條件下細(xì)胞ROS均明顯升高(P<0.01)，3%O2條件下細(xì)胞增殖升高(P<0.01)；HIF-1α、AR表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)；在3%O2條件下依達(dá)拉奉干預(yù)后，ROS明顯降低(P<0.01)，HIF-1α明顯下調(diào)(P<0.05)；細(xì)胞增殖明顯下降(P<0.01)。結(jié)論低氧及低氧環(huán)境刺激產(chǎn)生的ROS在前列腺增生中可能起關(guān)鍵作用。

低氧；活性氧；低氧誘導(dǎo)因子-1α；雄激素受體；前列腺增生

局部缺氧和炎癥反應(yīng)是前列腺增生兩大病因?qū)W說(shuō)〔1〕，活性氧(ROS)是兩大病因?qū)W說(shuō)中的關(guān)鍵因子。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是缺氧條件下調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)平衡的重要因子，雄激素受體(AR)是前列腺細(xì)胞增殖的重要基因。本文探討ROS、HIF-1α、AR在前列腺增生的發(fā)生發(fā)展中的角色。

1 材料與方法

1.1前列腺間質(zhì)原代細(xì)胞 人前列腺間質(zhì)細(xì)胞取自經(jīng)尿道前列腺電切組織，年齡67～86(平均72.5)歲，并經(jīng)病理證實(shí)為良性前列腺增生。對(duì)照組年齡37～46(平均43.5)歲，為男性膀胱癌患者6例，在膀胱癌手術(shù)過(guò)程中取其少量前列腺組織，經(jīng)病理證實(shí)排除前列腺增生和前列腺癌?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)。

1.2試劑、藥物及儀器 熒光探針Carboxy-H2-DCFDA(Invitrogen公司)，AnnexinⅤ FITC/PI凋亡及增殖檢測(cè)試劑盒(Beckman Coulter公司)，HIF-1α、AR的引物和熒光探針以及內(nèi)參GAPDH均為ABI公司訂購(gòu)的商用成品。氧自由基清除劑依達(dá)拉奉(南京森貝伽生物科技有限公司，純度>98.5%，批號(hào)89-25-8)。SQP-100S三氣培養(yǎng)箱(天津瑪福爾科技有限公司)，HT7900熒光定量PCR儀(ABI公司)，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.3前列腺間質(zhì)原代細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 按照原代培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法處理組織〔2〕后，置于37℃，21%O2，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代，取生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞爬片。根據(jù)取材前治療分為兩組：經(jīng)5α-還原酶抑制劑治療和未經(jīng)5α-還原酶抑制劑治療組，機(jī)械法粉碎增生前列腺組織后，用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞得到單細(xì)胞懸液。按照文獻(xiàn)報(bào)道方法〔3〕用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋Carboxy-H2-DCFDA探針終濃度為10 μmol/L，待檢測(cè)細(xì)胞去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的探針，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，離心細(xì)胞并收集，以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。兩種組織激發(fā)光均為氬離子激光488 nm譜線(xiàn)，使用儀器自帶的CellQest軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞凋亡和增殖 按照凋亡、增殖檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明要求處理細(xì)胞后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞增殖活性，WinMDI軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5低氧條件下觀察前列腺間質(zhì)細(xì)胞及ROS變化 取原代培養(yǎng)的前列腺間質(zhì)細(xì)胞第5～7代細(xì)胞進(jìn)行，將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞按氧濃度分組：細(xì)胞低氧培養(yǎng)用SQP-100S三氣培養(yǎng)箱，分別在3%O2，1%O2濃度下培養(yǎng)48 h，對(duì)照在21%O2下培養(yǎng)。按前述方法檢測(cè)各組細(xì)胞ROS、增殖活性和凋亡變化，HT7900熒光定量PCR儀檢測(cè)HIF-1α、AR mRNA變化。檢測(cè)方法為相對(duì)定量分析2-△△Ct法。HIF-1α、AR的引物和熒光探針以及內(nèi)參GAPDH均為ABI公司訂購(gòu)的商用成品，反應(yīng)條件及操作均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。每個(gè)樣品每次試驗(yàn)至少設(shè)立3個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.6依達(dá)拉奉干預(yù)對(duì)前列腺間質(zhì)細(xì)胞ROS、細(xì)胞生長(zhǎng)及HIF-1α、AR mRNA表達(dá)的影響 3%O2濃度下培養(yǎng)細(xì)胞，依達(dá)拉奉干預(yù)濃度為50、80 μmol/L。對(duì)照組予同劑量生理鹽水。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組ROS及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。熒光定量PCR法檢測(cè)HIF-1α、AR mRNA。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組ROS比較 免疫組化結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的人前列腺間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)5～7代后，其成分主要為平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，符合前列腺間質(zhì)細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn)。前列腺增生組織勻漿中ROS濃度〔(82.727±15.923)%〕較正常前列腺組織勻漿明顯升高〔(40.947±10.079)%,t=10.732,P<0.01〕，但21%O2培養(yǎng)細(xì)胞中ROS濃度明顯下降〔(31.680±11.079)%,t=-6.521,P<0.01〕。經(jīng)5α-還原酶抑制劑治療和未經(jīng)5α-還原酶抑制劑治療的前列腺組織中ROS濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(84.527±13.774)%、(82.727±15.923)%，t=2.032，P>0.05〕。3%O2培養(yǎng)后細(xì)胞ROS較21%O2明顯增高〔(84.094±10.994)%，P<0.01〕，依達(dá)拉奉干預(yù)可以降低ROS水平〔(37.380±9.986)%,t=-19.188,P<0.01〕。

2.2細(xì)胞增殖、凋亡情況 與21%O2培養(yǎng)〔(15.193±1.446)%〕相比，3%O2培養(yǎng)條件下細(xì)胞處于增殖期，G2/S期比例增多〔(21.267±2.866)%,t=7.809,P<0.01〕；依達(dá)拉奉干預(yù)則可降低G2/S期比例〔(18.362±1.681)%,t=3.523,P<0.01〕。與3% O2培養(yǎng)〔(2.685±0.35)%〕相比，1%O2細(xì)胞凋亡增加〔(27.919±4.249)%,t=-23.458,P<0.01〕，依達(dá)拉奉干預(yù)可上調(diào)細(xì)胞凋亡率〔(12.657±1.400)%,t=24.783,P<0.01〕。

2.3依達(dá)拉奉干預(yù)對(duì)前列腺組織間質(zhì)細(xì)胞ROS、增殖及HIF、AR mRNA的影響 與對(duì)照組細(xì)胞ROS水平〔(82.727±15.923)%〕比較，80 μmol/L依達(dá)拉奉可以明顯降低ROS水平〔(39.569±11.271)%，t=13.423,P<0.01〕，50 μmol/L依達(dá)拉奉組ROS水平無(wú)明顯變化〔(80.716±14.812)%，t=1.746,P>0.05〕。與對(duì)照組細(xì)胞增殖率〔(21.267±2.866)%〕比較，80 μmol/L依達(dá)拉奉組細(xì)胞增殖明顯下降〔(18.362±1.681)%，t=3.523,P<0.01〕。80 μmol/L依達(dá)拉奉組HIF-1α mRNA表達(dá)(2.657±0.413)較對(duì)照組明顯下降(2.828±0.318，t=2.708,P<0.05)，而AR mRNA表達(dá)(2.155±0.373)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2.335±0.443，t=2.040,P>0.05)。

3 討 論

前列腺增生的病因有許多學(xué)說(shuō)，但公認(rèn)的只有兩點(diǎn)：老化和有功能的睪丸。但目前用于抗雄激素治療的兩類(lèi)5α-還原酶抑制劑并不能阻止前列腺增生的臨床進(jìn)展，本研究檢測(cè)經(jīng)5α-還原酶抑制劑治療和未經(jīng)5α-還原酶抑制劑治療的前列腺組織中ROS的變化無(wú)差異。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)5α-還原酶抑制劑治療患者其前列腺組織中炎癥細(xì)胞的表達(dá)也是無(wú)差別的〔4〕。前列腺增生是一種公認(rèn)的老化性疾病，ROS在老化中的作用也日益受到重視〔5〕，但目前從老化角度研究前列腺增生的文獻(xiàn)較少。有理由認(rèn)為在老化因素作用下，前列腺局部微環(huán)境變化，導(dǎo)致了前列腺的第2次“發(fā)育”，但其關(guān)鍵的啟動(dòng)因素有待進(jìn)一步研究。老化的典型改變包括局部血管老化而繼發(fā)的損害，并由此導(dǎo)致局部缺血和低氧，研究已經(jīng)證實(shí)低氧在一定條件下可以刺激增殖〔6〕，因此我們推測(cè)低氧刺激可能就是前列腺增生的初始原因之一。低氧可以通過(guò)線(xiàn)粒體黃嘌呤氧化酶、吞噬細(xì)胞、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等途徑產(chǎn)生大量ROS〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)前列腺組織勻漿中ROS濃度明顯升高，但培養(yǎng)細(xì)胞中ROS濃度明顯下降，可能與培養(yǎng)細(xì)胞是在常氧條件下有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在適度的ROS刺激下，細(xì)胞開(kāi)始增殖并同時(shí)表達(dá)DNA修復(fù)因子和抗氧化酶〔8〕。盡管不同組織來(lái)源的細(xì)胞對(duì)ROS反映的濃度是不一致的，但共同的一點(diǎn)是：低濃度刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者死亡〔6〕。ROS本身或者進(jìn)一步激活其他增殖、凋亡相關(guān)基因，可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖或者凋亡，除涉及ROS本身的濃度和類(lèi)別外，還涉及不同的細(xì)胞類(lèi)型、密度、信號(hào)傳導(dǎo)通路、DNA表達(dá)和酶激活等方面。HIF-1α是缺氧條件下廣泛存在于人體內(nèi)的一種調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)平衡的重要因子，HIF-1α可以進(jìn)一步啟動(dòng)下游一系列生長(zhǎng)調(diào)控基因，使得機(jī)體適應(yīng)低氧，并在低氧環(huán)境下繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，在許多腫瘤研究中已經(jīng)證實(shí)。AR激活后可以啟動(dòng)、明顯促進(jìn)前列腺細(xì)胞的增殖〔9〕。本研發(fā)現(xiàn)在低氧刺激后，前列腺間質(zhì)細(xì)胞HIF-1α、AR mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，前列腺間質(zhì)細(xì)胞處于增殖期。而當(dāng)依達(dá)拉奉干擾ROS后，前列腺間質(zhì)細(xì)胞的HIF-1α mRNA表達(dá)下調(diào)，盡管AR mRNA無(wú)明顯變化，但前列腺間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。ROS與HIF-1α、AR及依達(dá)拉奉的相互關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。局部炎癥反應(yīng)在前列腺增生的中的作用日益受到重視〔1〕，炎癥刺激可以通過(guò)白細(xì)胞內(nèi)NADPH途徑產(chǎn)生大量ROS〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)適度的ROS可以刺激前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖，依達(dá)拉奉干預(yù)ROS后，細(xì)胞增殖下降，并出現(xiàn)凋亡增加。因此，低氧環(huán)境刺激產(chǎn)生的活性氧在前列腺增生可能起關(guān)鍵作用，提示改善局部缺氧狀態(tài)和抑制局部ROS可能是前列腺增生治療的新方向。

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R697+.32

A

1005-9202(2017)24-6021-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.007

青海省自然科學(xué)基金(No.2012-Z-939Q)

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科

任海林(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事泌尿系統(tǒng)相關(guān)疾病研究。

李曉娜(1978-)，女，碩士，副主任技師，主要從事高原醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。

〔2016-01-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)