劉琴，陳芳，王麗平，張宜

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，武漢 430070)

研究進展

脂肪干細胞成骨分化的研究進展

劉琴，陳芳，王麗平，張宜*

(中國人民解放軍武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗科，武漢 430070)

隨著骨組織工程研究取得較好的發(fā)展，涌現(xiàn)出各類種子細胞。脂肪干細胞，來自脂肪組織，具有諸多的優(yōu)勢，成為骨組織工程研究的熱點種子細胞之一。本文綜述了脂肪干細胞成骨分化的誘導方法、過程、驗證方法、影響成骨分化的供體因素和實驗因素，并對其未來研究方向進行了展望。

組織工程；脂肪干細胞；成骨分化

1 誘導脂肪干細胞成骨分化的方法

1.1化學誘導法

化學誘導法是目前最常用的成骨分化方法。最早發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞存在的研究者為Zuk等[3]，他們將含有適宜濃度β甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate, β-GP)、抗壞血酸(vitamin C, VC)、維生素D、地塞米松(dexamethasone, Dex)的培養(yǎng)液作為脂肪干細胞的成骨誘導液。隨后研究者們將Zuk等采用的脂肪干細胞成骨誘導液組分作為經(jīng)典的參考。大部分研究者所用的成骨誘導液成分大致相同，但組分的濃度存在很大差異，不同種屬脂肪干細胞成骨誘導液組分濃度不同，即使是同一種屬分離出來的脂肪干細胞成骨誘導液組分濃度也存在區(qū)別。β-GP在使用濃度上存在的差異不大，大部分研究者使用10 mmol/L β-GP，僅少數(shù)采用2 mmol/L。維生素D不是成骨誘導液配方的主流。VC的濃度存在較大差異，50 ng/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、50 mg/mL均有。Dex濃度為1、10、100 nmol/L，特別的是有些研究者并未使用地塞米松。王偉等[5]分別用含0、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Dex的成骨誘導培養(yǎng)液進行脂肪干細胞成骨誘導，發(fā)現(xiàn)隨著Dex濃度的增加，細胞的增殖活性下降，10 μmol/L組細胞均死亡；成骨特異性基因骨鈣素和核心結(jié)合因子α1 (core binding factor α1，Cbfαl) 又稱Runx2也受到相應的影響，認為10 nmol/L Dex組成的成骨誘導液在使細胞增殖活性受到較小抑制的同時取得更好的成骨誘導效果。王偉等的實驗同時也證實Dex不是脂肪干細胞向成骨細胞分化的必備條件。Kyll?nen等[6]比較了人脂肪干細胞在10 mmol/L β-GP +50 μmol/L VC +100 nmol/L Dex、10 mmol/L β-GP +150 μmol/L VC +10 nmol/L Dex、10 mmol/L β-GP +250 μmol/L VC +5 nmol/L Dex三種成骨誘導培養(yǎng)液條件下的成骨能力，發(fā)現(xiàn)在10 mmol/L β-GP +250 μmol/L VC +5 nmol/L Dex條件下成骨能力最強，在10 mmol/L β-GP +50 μmol/L VC +100 nmol/L Dex條件下成骨能力最弱，表明成骨誘導液中各組分濃度的不同影響脂肪干細胞的成骨能力。

1.2細胞共培養(yǎng)法

細胞共培養(yǎng)技術是將兩種或兩種以上的細胞共培養(yǎng)于同一種環(huán)境中，此法的優(yōu)點在于能夠更好地反映體內(nèi)微環(huán)境中細胞間的相互作用關系。Correia等[7]將大鼠脂肪干細胞與血管內(nèi)皮細胞裝入由多聚L-賴氨酸、海藻酸鈉、殼聚糖逐層組裝成的半透膜膠囊內(nèi)，再將此膠囊培養(yǎng)于不含成骨誘導因子的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液內(nèi)，發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞能夠分化為成骨細胞，可能的機制為此膠囊在成骨分化中起著血管內(nèi)皮生長因子和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)的作用。Liu等[8]將兔脂肪干細胞與成骨細胞共培養(yǎng)于含5%或10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)誘導后第7天部分兔脂肪干細胞變圓，第14天茜素紅染色陽性、堿性磷酸酶染色陽性。

1.3自發(fā)成骨法

自發(fā)成骨法即在不添加成骨誘導相關因子的前提下，脂肪干細胞能夠分化為成骨細胞，茜素紅染色為陽性并表達成骨細胞相關的基因。Liu等[9]取傳代至第12代大鼠脂肪干細胞以正常密度接種，或者取第3代大鼠脂肪干細胞以低密度接種，在不加任何成骨誘導因子的前提下，均能夠自發(fā)成骨，表明連續(xù)傳代一定時間后或者以低密度接種的大鼠脂肪干細胞具有自發(fā)成骨的能力。

1.4其他方法

Carbone等[10]首先把牙髓干細胞分化為成骨細胞，收集分化過程中的上清液，再將此上清液來培養(yǎng)人脂肪干細胞，人脂肪干細胞能夠向成骨細胞分化。Oliveira等[11]在脂肪干細胞基礎培養(yǎng)液中加入甲基丙烯酸酯結(jié)冷膠水凝膠或者含有不同濃度Ⅰ型膠原蛋白的甲基丙烯酸酯結(jié)冷膠水凝膠，人脂肪干細胞能夠分化為成骨細胞，可能的機制是依賴于肌動蛋白-肌球蛋白收縮通路的力傳導現(xiàn)象。Shiraishi等[12]在培養(yǎng)液中添加300～500 ng/mL BMP-2而不添加成骨誘導因子，脂肪干細胞分化為成骨細胞。Ren等[13]將pcDNA3.1-hBMP-7轉(zhuǎn)染兔脂肪干細胞，兔脂肪干細胞可以分化為成骨樣細胞。

2 脂肪干細胞成骨分化的過程

脂肪干細胞分化為成熟的骨組織需要經(jīng)歷兩個階段，第一階段大致為脂肪干細胞先后經(jīng)歷成骨干細胞、成骨前體細胞、過渡性成骨細胞3個過程直到成骨細胞成熟，第二階段為成熟的成骨細胞增殖，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)鈣化，即鈣結(jié)節(jié)的出現(xiàn)，鈣結(jié)節(jié)的生成是脂肪干細胞能夠分化為成骨細胞的有力證據(jù)[14]。脂肪干細胞在向成骨細胞分化的過程中細胞形態(tài)也發(fā)生了相應的變化，體外誘導5 d左右，少量細胞的形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切?、類圓形或者不規(guī)則形；而后隨著誘導時間的增加，可見細胞呈明顯的簇狀生長；14 d左右細胞行茜素紅染色，即可見到深紅色的礦化鈣結(jié)節(jié)[15]。

3 驗證脂肪干細胞分化成骨的方法

脂肪干細胞在向成骨細胞分化的過程中會產(chǎn)生特異性的蛋白、受體、因子等，如堿性磷酸酶(ALP)、礦化結(jié)節(jié)、成骨細胞相關基因與蛋白等。

3.1堿性磷酸酶檢測

堿性磷酸酶是成骨分化早期的特異性標志酶，在誘導3～4 d左右出現(xiàn)，1～2周時表達量處于較高水平，隨后下降，故大多數(shù)研究者在脂肪干細胞成骨誘導后1周或2周時進行堿性磷酸酶的檢測。此酶的檢測有2種方法，一是染色法進行定性檢測，如Gomori鈣鈷法、偶氮偶聯(lián)法又稱偶聯(lián)法；二是用堿性磷酸酶染色試劑盒進行定量檢測。

3.2鈣結(jié)節(jié)染色法

鈣結(jié)節(jié)是脂肪干細胞向成骨細胞誘導分化最后階段形成的細胞外基質(zhì)，大多數(shù)研究者在成骨誘導后2周或3周時進行鈣結(jié)節(jié)染色。鈣結(jié)節(jié)染色方法有2種：茜素紅染色法、von Kossa’s染色法。

3.3相關基因或蛋白檢測

脂肪干細胞在成骨誘導分化下，可表達一系列成骨細胞相關的基因和蛋白，如Runx2、堿性磷酸酶、I型膠原、骨鈣蛋白(osteocalcin, OCN)、骨鈣素(osteocalsin, OC)、骨粘連蛋白、骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9等[14]。

3.4其他驗證方法

葛雯姝等[16]把含有OC基因啟動子的熒光素酶報告載體pLVX-OCpro-Luc-Puro進行慢病毒包裝后感染人脂肪干細胞，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定整合OCpro-Luc-Puro的細胞株，將此細胞株進行成骨誘導，在誘導的第7天和第14天進行相關檢測，發(fā)現(xiàn)熒光素酶表達的趨勢與茜素紅染色定量及成骨相關基因表達水平一致。該熒光素酶報告系統(tǒng)可以實時評價人脂肪干細胞成骨分化情況，為成骨檢測提供了一種新的方法，并且借助此系統(tǒng)可以高通量篩選影響人脂肪干細胞成骨分化的重要因子。

4 影響脂肪干細胞成骨分化的供體因素和實驗因素

4.1供體因素

4.1.1 供體種屬

目前已從人、鼠、馬、兔、豬等分離培養(yǎng)出脂肪干細胞，但是從不同種屬分離出來的脂肪干細胞其成骨能力存在著不同。Ni等[17]比較了人、大鼠、兔皮下脂肪來源脂肪干細胞成骨能力的差異，與人、大鼠相比，兔脂肪干細胞成骨分化能力較差。李江璇等[18]研究也發(fā)現(xiàn)與人脂肪干細胞相比，兔脂肪干細胞成骨能力較弱，認為在進行成骨分化研究時不作為首選細胞。

4.1.2 供體年齡

研究者們對供體年齡是否影響脂肪干細胞成骨分化的能力未達成共識。Shi 等[19]、Ding等[20]認為年齡與人脂肪干細胞成骨能力無關。而Kornicka等[21]的研究發(fā)現(xiàn)隨著供體年齡的增加，人脂肪干細胞成骨能力下降，成脂能力增加。Ye等[22]比較了不同年齡階段的人下眼瞼突出脂肪墊的脂肪干細胞，發(fā)現(xiàn)年齡影響脂肪干細胞的成骨能力。

4.1.3 供體性別

Aksu等[23]認為男性來源的脂肪干細胞成骨分化能力優(yōu)于女性來源的脂肪干細胞，說明供體性別影響著脂肪干細胞成骨分化的能力。

4.1.4 供體健康狀態(tài)

目前對供體健康狀態(tài)對脂肪干細胞成骨分化能力的影響報道不一致。Eterno 等[24]認為正常人和從乳腺癌患者提取的脂肪干細胞的成骨分化能力無明顯的區(qū)別。Marycz等[25]從患有代謝綜合征馬尾處獲得的脂肪干細胞的成骨能力與健康馬脂肪干細胞相比，前者的成骨能力下降，其機制是通過破壞線粒體的結(jié)構從而降低BMP-2和Ⅰ型膠原的表達。Strong等[26]、De Girolamo等[27]比較了來源于消瘦者和肥胖者的脂肪干細胞的成骨能力，發(fā)現(xiàn)肥胖抑制脂肪干細胞的成骨能力。Cheng等[28]研究認為來源于糖尿病人與健康人的脂肪干細胞的成骨能力無區(qū)別。報道存在差異的原因可能是供體種屬和所患病癥不同。

4.1.5 脂肪取材部位

脂肪獲取部位對脂肪干細胞成骨分化能力的影響仍未達成共識。Jurgens等[29]認為取材部位不影響人脂肪干細胞成骨分化的能力。De Girolamo等[27]認為來源于皮下和內(nèi)臟的人脂肪干細胞有著不同的成骨能力。Russo等[30]比較了來源于人皮下、大網(wǎng)膜、胸廓內(nèi)的脂肪干細胞成骨能力，發(fā)現(xiàn)來源于大網(wǎng)膜的人脂肪干細胞成骨能力最強。Di Taranto等[31]認為來源于淺層脂肪組織的人脂肪干細胞的成骨能力優(yōu)于來源于深層脂肪組織的人脂肪干細胞的成骨能力。Requicha等[32]認為來源于皮下和大網(wǎng)膜的犬脂肪干細胞的成骨分化能力有著不同。另有研究者比較了來源于兔腹股溝、腹膜后、頸背部三種脂肪干細胞的成骨能力，發(fā)現(xiàn)在成骨誘導中以腹股溝部脂肪干細胞形成的結(jié)節(jié)最大，腹股溝部脂肪干細胞的堿性磷酸酶活性高于腹膜后及頸背部[33]。Ardeshirylajimi等[34]研究發(fā)現(xiàn)來源于駝峰的脂肪干細胞的成骨能力比來源于腹部的脂肪干細胞的成骨能力強。

4.2實驗因素

4.2.1 取材方法

Duscher等[35]、Barzelay等[36]、Panetta等[37]認為由抽脂術或組織切除術獲得的人脂肪干細胞的成骨能力無區(qū)別。然而，Gnanasegaran等[38]認為由抽脂術獲得的人脂肪干細胞的成骨能力強于由組織切除術獲得的人脂肪干細胞的成骨能力。

4.2.2 分離方法

不同分離方法對脂肪干細胞的成骨能力有著不同的影響。Markarian等[39]比較了0.1% I型膠原酶消化30 min、12.5 μg/mL胰酶消化30 min或60 min、25 μg/mL胰酶消化30 min或60 min、37.5 μg/mL胰酶消化30 min幾種分離方法所得人脂肪干細胞的成骨能力，發(fā)現(xiàn)由12.5 μg/mL胰酶消化60 min、25 μg/mL胰酶消化60 min獲得的脂肪干細胞的成骨能力優(yōu)于其他幾種方法。

4.2.3 培養(yǎng)液

培養(yǎng)液的種類、血清濃度、糖濃度都可在一定程度上影響脂肪干細胞成骨分化的能力。①基礎培養(yǎng)液：在目前已報到的成骨誘導液組成成分中，基礎培養(yǎng)液的種類很多，基礎培養(yǎng)液種類的不同可能影響脂肪干細胞成骨分化的能力。Roxburgh等[40]比較了DMEM-H+10% FBS、DMEM-L+10% FBS、M199+10% FBS+5 ng/mL肝素+2 ng/mL FGF、DMEM-F12+10% FBS、advanced DMEM:F12+ 2% FBS、IMDM:HAM’s F12 1∶1+10% FBS幾種培養(yǎng)條件下人脂肪干細胞的成骨能力，認為其在DMEM-H+10% FBS、DMEM-L+10% FBS、IMDM:HAM’s F12 1∶1+10% FBS三種條件下的成骨能力比較好。②血清：血清的種類、濃度也在一定程度上影響著脂肪干細胞的成骨分化。大多數(shù)研究者采用的血清體積分數(shù)為10%，過低或過高都不利于脂肪干細胞成骨分化。Kyll?nen等[6]比較了人脂肪干細胞在含人血清、無血清、胎牛血清3種成骨誘導培養(yǎng)液條件下的成骨能力，發(fā)現(xiàn)其在含胎牛血清成骨誘導培養(yǎng)液中的成骨能力最弱。Sato等[41]用無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)人脂肪干細胞，與含血清體系培養(yǎng)人脂肪干細胞相比，前者體內(nèi)體外的成骨能力都更強。③糖濃度：Cheng等[28]將來源于健康供體的人脂肪干細胞分別培養(yǎng)于含高糖(4.5 g/L)和低糖(1.0 g/L)的成骨誘導液中，發(fā)現(xiàn)人脂肪干細胞在兩種條件的成骨能力無區(qū)別，只是在高糖條件下人脂肪干細胞的細胞遷移力降低、衰老增加，并且氧化反應水平高。

4.2.4 細胞代數(shù)

對于細胞代數(shù)對脂肪干細胞成骨能力的影響還存在一定的爭議。Liu等[9]比較了第3～12代大鼠脂肪干細胞的成骨能力，發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加大鼠脂肪干細胞成骨能力增強，有趣的是成脂能力反而下降。El Atat等[42]比較了第1～4代人脂肪干細胞的成骨能力，發(fā)現(xiàn)細胞代數(shù)并不影響人脂肪干細胞的成骨能力。Yu等[43]認為隨著細胞代數(shù)增加人脂肪干細胞成骨能力下降，第10代是人脂肪干細胞各項功能的臨界點。

4.2.5 凍存

目前關于凍存對脂肪干細胞成骨能力影響的報道不統(tǒng)一。López等[44]認為凍存人脂肪干細胞復蘇后其成骨能力與凍存前相比沒有變化。Shah等[45]認為凍存降低人脂肪干細胞的成骨能力。James等[46]通過體內(nèi)體外實驗發(fā)現(xiàn)凍存影響人脂肪干細胞的成骨能力。

4.2.6 細胞融合度

張彬等[47]將初始密度相同的大鼠脂肪干細胞接種到培養(yǎng)皿，分別在細胞接種時、50%～60%融合時、85%～95%融合時加入成骨誘導培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)在85%～95%融合時加入成骨誘導培養(yǎng)液大鼠脂肪干細胞的成骨能力最強。

4.2.7 細胞倍增次數(shù)

細胞倍增次數(shù)在一定程度上影響著脂肪干細胞的成骨能力。Plastini等[48]的研究發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞細胞倍增次數(shù)在6.1～6.2區(qū)間時，不影響其成骨能力；而長期培養(yǎng)后細胞倍增次數(shù)達10.1時，其成骨能力下降。

5 總結(jié)與展望

脂肪干細胞是骨組織工程熱門的種子細胞之一，最主要的原因是脂肪干細胞具有取材方便、低免疫原性、成骨分化的能力等特性。脂肪干細胞成骨分化的方法有化學誘導法、細胞共培養(yǎng)法、自發(fā)成骨法等，化學誘導法仍是主流的方法，但是目前關于成骨誘導培養(yǎng)液中各組分的濃度存在很大的差異，已有研究者證實各組分的差異會導致成骨能力存在不同。驗證成骨分化是否成功需結(jié)合堿性磷酸酶、鈣結(jié)節(jié)、相關成骨基因的幾個方面進行檢測。

本文還從供體因素和實驗因素兩個角度總結(jié)了影響脂肪干細胞成骨分化的部分因素。不同供體種屬來源的脂肪干細胞成骨能力存在差異，從已發(fā)表的研究來看，兔脂肪干細胞成骨能力比人脂肪干細胞成骨能力差，有的研究者甚至建議進行成骨分化研究時不考慮將兔脂肪干細胞作為首選細胞。供體性別對脂肪干細胞成骨分化影響的研究較少。供體年齡、健康狀態(tài)、脂肪取材部位是否對脂肪干細胞成骨分化造成影響還有待進一步研究。脂肪組織取材方法、分離方法、培養(yǎng)液、細胞代數(shù)、凍存、細胞融合度、細胞倍增次數(shù)都在一定程度上影響脂肪干細胞成骨能力，但是對于取材方法、細胞代數(shù)和凍存是否對脂肪干細成骨能力造成影響還有一定的爭議。從已有研究來看，進行脂肪干細胞成骨研究時，研究者推薦采用的培養(yǎng)液有DMEM-L+10% FBS、IMDM:HAM’s F12 1∶1+10% FBS，新鮮未凍存不超過第10代的脂肪干細胞進行成骨誘導分化研究。

鑒于脂肪干細胞在骨組織工程中的重要性，有以下兩個方面是亟需解決的：①找到不同種屬脂肪干細胞成骨誘導培養(yǎng)液各組分的最佳濃度，統(tǒng)一不同種屬脂肪干細胞成骨誘導培養(yǎng)液組分的濃度；②弄清楚上述對脂肪干細胞成骨分化影響存在爭議的事項，包括供體年齡、供體健康狀態(tài)、脂肪取材部位、細胞代數(shù)和凍存。

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Researchprogressonosteogenicdifferentiationofadipose-derivedstemcells

LIU Qin, CHEN Fang, WANG Li-ping, ZHANG Yi*

(Department of Medical Experiments, Wuhan General Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Wuhan 430070, China)

With the good progress of bone tissue engineering, various kinds of seed cells have emerged. Adipose derived stem cells (ASCs) have many advantages, and become one of the hot seed cells in bone tissue engineering. This review focused on their induction method, induction process and verification method, and the donor factors and experimental factors affecting the osteogenic differentiation were summarized. We also looked forward the future research interest of ASCs’ osteogenic differentiation.

Tissue engineering; Adipose-derived stem cells; Osteogenic differentiation

ZHANG Yi. E-mail： abcd1566@sina.com

2017-05-05

劉琴(1986-)，女，技師，碩士，從事細胞生物學和分子生物學方面的研究。E-mail： liuqin_0629@163.com

張宜(1965-)，男，碩士，主任藥師，從事藥學信息研究。E-mail： abcd1566@sina.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0581-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.021

1993年，Langer和Vacanti首次提出了組織工程的基本含義[1]。隨后組織工程尤其是骨組織工程取得了飛速的發(fā)展。骨組織工程的進步為骨缺損修復提供了新的思路，在一定程度上克服了傳統(tǒng)骨缺損修復所存在的缺點，如免疫排斥反應、二次損傷、可移植部位及數(shù)量有限等[2]。骨組織工程的關鍵之一是選擇合適的種子細胞。脂肪干細胞因其具有來源豐富、取材簡便、多向分化能力等特點，是骨組織工程理想的種子細胞之一[3]。目前，關于脂肪干細胞成骨分化的研究已比較多，但是在很多方面仍缺乏系統(tǒng)的歸納與總結(jié)。故，本文綜述了脂肪干細胞成骨分化的誘導方法、過程、驗證方法，影響成骨分化的供體因素和實驗因素，并對其未來研究方向進行了展望。

2017-02-16