孫志亮，李洪利，尹崇高

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、2.醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心、3.護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053)

TGF-β1通過F-actin聚合促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

孫志亮1，李洪利2，尹崇高3

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1.生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、2.醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心、3.護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053)

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細(xì)胞失去極性，獲得間質(zhì)形態(tài)的一個(gè)過程[1]。腫瘤細(xì)胞中，EMT的激活促進(jìn)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 屬于TGF家族，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的生成等[2]。在生理和病理狀態(tài)下，TGF-β1都是EMT發(fā)生的主要誘導(dǎo)因子之一。本文通過TGF-β1誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7，檢測(cè)細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白vimentin、E-cadherin的表達(dá)，F(xiàn)-actin的聚合情況以及LIMK、cofilin的磷酸化水平，進(jìn)一步闡明TGF-β1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 EMT的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 TGF-β1購自Peprotech公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、鼠抗人vimentin單克隆抗體均購自Santa Cruz；兔抗人p-LIMK單克隆抗體、兔抗人LIMK單克隆抗體、兔抗人p-cofilin單克隆抗體、 兔抗人cofilin單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；鬼筆環(huán)肽購自eBioscience；胎牛血清和MEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7培養(yǎng)在含10%的胎牛血清、青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，置于含5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪到6孔板中，待其長到70%左右時(shí)棄去培養(yǎng)液，加入無血清的MEM培養(yǎng)基饑餓12 h后。將人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7分組：A組細(xì)胞不加TGF-β1，作為陰性對(duì)照；B組細(xì)胞用TGF-β1進(jìn)行誘導(dǎo)刺激。以時(shí)間梯度24、48、72 h進(jìn)行誘導(dǎo)刺激。

1.2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 按文獻(xiàn)[3]的步驟進(jìn)行操作。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野， 對(duì)穿到人工基膜底部的細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均數(shù)作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 F-actin聚合實(shí)驗(yàn) 將A、B兩組細(xì)胞的懸濁液鋪在激光共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)72 h后，用4%的多聚甲醛固定。PBS清洗，加入1% 的BSA進(jìn)行封閉。封閉20 min后，加入phalloidin(1 ∶50)于37℃孵育箱中孵育1 h。PBS清洗，隨后加入DAPI染核，染核20 min后，加入抗淬滅劑封片。

1.2.4 Western blot 細(xì)胞提取總蛋白，以等量蛋白上樣到12%的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，電泳后蛋白分離并轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h。TBST洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑ECL，X線膠片曝光。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1促進(jìn)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT Western blot 結(jié)果顯示，在用TGF-β1誘導(dǎo)的時(shí)間梯度24、48、72 h中，刺激時(shí)間在72 h發(fā)生EMT最為明顯。乳腺癌細(xì)胞MCF-7中E-cadherin蛋白水平下調(diào)，而vimentin蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。

2.2 TGF-β1促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞MCF-7的侵襲 Transwell侵襲結(jié)果顯示，用TGF-β1誘導(dǎo)72 h的MCF-7細(xì)胞，其穿到濾膜底部的細(xì)胞數(shù)明顯多于未用TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT后F-actin聚合作用的變化情況 免疫熒光檢測(cè)F-actin 聚合的變化結(jié)果顯示，在用TGF-β1誘導(dǎo)72 h后， TGF-β1誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中F-actin 的聚合作用比未誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7明顯增加(P<0.05 )。

2.4 TGF-β1促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞中LIMK和cofilin的磷酸化 檢測(cè)了LIMK和cofilin的磷酸化水平。結(jié)果顯示，用TGF-β1誘導(dǎo)72 h后，LIMK和cofilin的磷酸化明顯增加 (P<0.05 )。

3 討論

肌動(dòng)蛋白解聚因子絲切蛋白家系(ADF/cofilin)是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它能夠切割F-actin，加快F-actin的解聚[4]。cofilin通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架的重塑，對(duì)肌動(dòng)蛋白相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)具有重要作用[5-6]。LIMK是cofilin的上游信號(hào)分子，通過磷酸化cofilin氨基端第3位絲氨酸(Ser-3)使得cofilin失去解聚肌動(dòng)蛋白的能力，提高F-actin的穩(wěn)定性。F-actin 的聚合與解聚合與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)-actin的解聚使得RhoA失活，促進(jìn)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Smad1/2/3由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，發(fā)生EMT的逆轉(zhuǎn)[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在誘導(dǎo)MCF-7發(fā)生EMT的過程中p-LIMK、p-cofilin的表達(dá)明顯增強(qiáng)， F-actin的聚合明顯增加。E-cadherin蛋白水平下調(diào)，而vimentin蛋白水平上調(diào)。結(jié)果證實(shí)TGF-β1可以通過LIMK/cofilin信號(hào)通路影響F-actin的聚合，促使EMT的發(fā)生，闡述了TGF-β1促進(jìn)EMT的發(fā)生機(jī)制，為抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移以及提高乳腺癌患者的生存率提供了理論依據(jù)。

[1] Song Q, Xu Y, Yang C, et al. miR-483-5p promotes invasion and metastasis of lung adenocarcinoma by targeting RhoGDI1 and ALCAM[J].CancerRes， 2014, 74(11): 3031-42.

[2] Kajdaniuk D, Marek B, Borgiel-Marek H, et al. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) in physiology and pathology[J].EndokrynolPol， 2013, 64(5): 384-96.

[3] 田紅艷, 陳萍萍, 李 笑, 等. Gab2通過PI3K/Akt/ARK5/MMP途徑影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[J].中國藥理學(xué)通報(bào)， 2015, 31(7): 1014-8.

[3] Tian H Y, Chen P P, Li X , et al. Gab2 effects the invasion and metastasis of breast carcinoma through PI3K/Akt/ARK5/MMP signal pathway[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(7):1014-8.

[4] Kanellos G, Frame M C. Cellular functions of the ADF/cofilin family at a glance[J].JCellSci， 2016, 129(17): 3211-8.

[5] Bravo-Cordero J J, Magalhaes M A, Eddy R J, et al. Functions of cofilin in cell locomotion and invasion[J].NatRevMolCellBiol， 2013, 14(7): 405-15.

[6] Mizuno K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation[J].CellSignal， 2013, 25(2): 457-69.

[7] Shankar J, Nabi I R. Actin cytoskeleton regulation of epithelial-mesenchymal transition in metastatic cancer cells[J].PLoSOne， 2015, 10(7): e0132759.

TGF-β1 promotes epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cell line MCF-7 through F-actin polymerization

SUN Zhi-liang1, LI Hong-li2, YIN Chong-gao3

(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology, 2.MedicineResearchCenter, 3.CollegeofNursing,WeifangMedicalUniversity,WeifangShandong261053,China)

TGF-β1；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；肌動(dòng)蛋白絲聚合；LIM激酶；肌動(dòng)蛋白解聚因子；乳腺癌

TGF-β1; EMT; F-actin polymerization; LIMK; cofilin; breast cancer

2017-01-22，

2017-02-27

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No 81402389)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No ZR2015HL065)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃(No J12LK03，J13LK03)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No 201510438011)；濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No KX2015012)

孫志亮(1995-)，男，學(xué)士，研究方向：腫瘤病理學(xué)，E-mail：szlwfmcswjs@163.com； 李洪利(1977-)，女，碩士，副教授，研究方向：腫瘤病理學(xué)，通訊作者，E-mail：ycglihongli@163.com

時(shí)間：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.056.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.028

A

1001-1978(2017)05-0735-02

R329.24；R341；R737.902.2；R977.6