陳曉旭，曾文先

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

特別報(bào)道

編者按

2017年《中國畜牧雜志》全面改版。為更好展示畜牧學(xué)領(lǐng)域的科技前沿，促進(jìn)學(xué)術(shù)交流，本刊特別邀請不同領(lǐng)域的專家或青年骨干，圍繞各自的研究領(lǐng)域，介紹自己、團(tuán)隊(duì)或國際研究機(jī)構(gòu)近幾年的研究成果、存在問題及研究展望，或就當(dāng)前的研究熱點(diǎn)問題進(jìn)行討論和評(píng)論。2017年第一期自副主編開始，將為讀者帶來相關(guān)綜述，希望能引發(fā)讀者對相關(guān)熱點(diǎn)、難點(diǎn)的思考，并進(jìn)行深入探討。

精子發(fā)生中miRNAs調(diào)控功能研究進(jìn)展

陳曉旭，曾文先*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

源源不斷的精子發(fā)生過程是雄性繁殖機(jī)能的基礎(chǔ)。精原干細(xì)胞（SSCs）持續(xù)不斷地自我更新和分化又是精子發(fā)生的基礎(chǔ)。精子發(fā)生起始于精原干細(xì)胞的分化，歷經(jīng)漫長的減數(shù)分裂后形成單倍體圓形精細(xì)胞。后者經(jīng)過變態(tài)發(fā)育過程，最終形成精子并釋放到曲細(xì)精管管腔中[1]。研究表明，成千上萬的基因參與了精子發(fā)生過程，然而如何實(shí)現(xiàn)對這些基因精確有效的調(diào)控還有待研究。MicroRNAs（miRNAs）作為一類長度為22 nt的單鏈非編碼小RNA，主要參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。近年來的研究表明，miRNAs參與調(diào)控雄性生殖細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡。本文主要針對精子發(fā)生過程中miRNAs在睪丸不同細(xì)胞類型中的調(diào)控功能進(jìn)行綜述。

1 miRNAs的生成與作用機(jī)制

miRNAs的轉(zhuǎn)錄與其在基因組中的位置相關(guān)。在眾多miRNAs基因中，大約有一半的miRNAs位于基因的內(nèi)含子中，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控與宿主基因一致或者不依賴于宿主基因。另外，部分miRNAs基因則成簇存在并共有相同的啟動(dòng)子，因此這些miRNAs基因具有相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[2]。miRNAs基因轉(zhuǎn)錄成pri-miRNAs，經(jīng)過Drosha和DGCR8的加工并生成pre-miRNAs。這些pre-miRNAs會(huì)在EXP5-Ran·GTP復(fù)合物的作用下運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步被Dicer加工成雙鏈的RNA[3]。雙鏈的RNA會(huì)在AGO蛋白形成的miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體中進(jìn)一步成熟為具有生物學(xué)功能的miRNAs。miRNAs調(diào)控基因的表達(dá)主要通過堿基互補(bǔ)配對的方式誘導(dǎo)mRNA的降解或翻譯抑制。這種調(diào)控識(shí)別方式主要依賴于成熟miRNAs第2～8位堿基的種子序列，因此，1個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)基因，同樣的1個(gè)基因也可被多個(gè)miRNAs調(diào)控[4]。

最新的研究表明，N6-腺嘌呤甲基化修飾（m6A）參與調(diào)控miRNAs的生成。Alarcon等[5]報(bào)道，HNRNPA2B1能夠結(jié)合pri-miRNAs的m6A修飾位點(diǎn)，并與DGCR8結(jié)合促進(jìn)pri-miRNAs的加工；當(dāng)細(xì)胞中缺少HNRNPA2B1或者m6A甲基化酶METTL3時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中未加工的pri-miRNAs水平上升，并降低成熟miRNAs的表達(dá)水平。因此，miRNAs生成受到m6A的調(diào)控。同時(shí)，miRNAs可以通過堿基互補(bǔ)配對的方式調(diào)控m6A修飾的形成。這種調(diào)控方式主要通過抑制METTL3與mRNA的結(jié)合，最終改變mRNA上的m6A修飾水平。m6A修飾水平的微妙變化能夠改變mRNA的穩(wěn)定性，從而調(diào)控基因的表達(dá)[6]。

2 miRNA在精子發(fā)生中的作用

2.1 Dicer條件性敲除模型鼠 Dicer條件性敲除模型鼠已被廣泛應(yīng)用于探究miRNAs在精子發(fā)生中的作用。Remero等[7]在出生前小鼠的原始精原細(xì)胞中敲除Dicer致使減數(shù)分裂異常、粗線期精母細(xì)胞凋亡、圓形精子減少以及精細(xì)胞形態(tài)異常。Koheron等[8]采用NGN3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶在A型精原細(xì)胞中敲除Dicer，則導(dǎo)致圓形精子細(xì)胞缺失，精子發(fā)生嚴(yán)重受阻；在早期精原細(xì)胞中Dicer的敲除也表現(xiàn)類似結(jié)果；在單倍體精子中敲除Dicer導(dǎo)致延長型精子以及精細(xì)胞的形態(tài)呈現(xiàn)異常，這些結(jié)果均表明miRNAs在精子發(fā)生調(diào)控中有著重要作用。

2.2 miRNA在精原干細(xì)胞自我更新及分化中的作用 SSCs位于睪丸曲細(xì)精管基部的微環(huán)境中，其自我更新與分化的平衡是確保雄性動(dòng)物源源不斷產(chǎn)生精子的基礎(chǔ)，并受到多種因子調(diào)控。神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）能夠作用于細(xì)胞表面的RET和GFRα1受體，激活PI3K/AKT或者SFK信號(hào)通路，調(diào)控SSCs的自我更新[9]。miRNAs也參與SSCs自我更新調(diào)控。研究表明，miR-20、miR-21、miR-34c-135a、miR -146a、miR-182、miR-183、miR -204、miR-465a-3p、miR-465b-3p、miR-465c-3p、miR-465c-5p、miR-544在SSCs中高豐度表達(dá)[10-11]。其中，miR-20、miR-21和 miR-106a能 夠 維 持 SSCs穩(wěn) 態(tài)。Moritoki等[12]研究表明，miR-135a通過轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的表達(dá)變化改變細(xì)胞表面膜受體RET蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控SSCs的命運(yùn)。而miR-544及miR-224均能夠通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PLZF影響SSCs的自我更新[13-14]。另外，SSCs的增殖則受到miR-34c以及miR-204調(diào)控[15-16]。

研究表明，維甲酸能夠誘導(dǎo)精原細(xì)胞的分化與減數(shù)分裂起始。維甲酸能夠下調(diào)生殖細(xì)胞內(nèi)miR-146、let7家族、miR-17-92、miR-106b-25和 miR-221/222表達(dá)水平[17-19]。其中，敲除miR-17-92導(dǎo)致SSCs以及精原細(xì)胞數(shù)量減少，并造成精子發(fā)生受損[19]。過表達(dá)miR-221/222能夠抑制維甲酸誘導(dǎo)的精原細(xì)胞分化。此外，miR-34c靶向于NANOS并上調(diào)減數(shù)分裂相關(guān)基因，從而調(diào)控SSCs的分化和減數(shù)分裂過程[20]。

2.3 miRNA調(diào)控減數(shù)分裂以及精子變態(tài)發(fā)育 越來越多的證據(jù)表明miRNAs參與減數(shù)分裂的調(diào)控。miR-449 和miR-34b/c的表達(dá)水平均隨著減數(shù)分裂的開始而上調(diào)。由于miR-449和miR-34b/c的種子序列相同，它們在調(diào)控精子發(fā)生中的作用有重疊，因此只有同時(shí)敲除miR-449和miR-34b/c才能導(dǎo)致精子發(fā)生障礙[21]。同時(shí)，miR-34b-5p能夠調(diào)控Cdk6的表達(dá)以調(diào)控減數(shù)分裂過程[22]。類似地，miR-18作為精母細(xì)胞中高豐度表達(dá)的miRNA，也通過調(diào)控Cdk6調(diào)控精子發(fā)生過程[23]。

精子發(fā)生中組蛋白依次被過渡蛋白（TPs）以及精蛋白（PRMs）替換是雄性生殖細(xì)胞特有的發(fā)育過程[24]。在減數(shù)分裂后期的生殖細(xì)胞中，TPs以及PRMs的精確表達(dá)是精子變態(tài)發(fā)育的先決條件。因此，為了確保這一過程準(zhǔn)確而有效地進(jìn)行，TPs和PRMs受到嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。現(xiàn)已證實(shí)，miR-469能夠抑制粗線期精母細(xì)胞以及圓形精子中TP2和PRM2的表達(dá)[25]，而miR-122a則是在生殖細(xì)胞后期高豐度表達(dá)且調(diào)控TP2基因的表達(dá)[26]。

盡管大量的miRNAs會(huì)在精子變態(tài)發(fā)育過程中丟失，但是精子中殘余的miRNAs同樣具有重要功能。miR-34c參與受精卵第1次分裂過程[27]，而精子中miR-424/322的表達(dá)紊亂誘導(dǎo)精子中雙鏈分子的斷裂[28]。通過探究弱精子癥患者與正常人中精子表達(dá)的差異，人們確定了一些潛在的可作為不孕標(biāo)記的miRNAs。以miR-151a-5p為例，miR-151a-5p在弱精子癥患者中高表達(dá)且參與線粒體的生物學(xué)功能[29]。

2.4 miRNA在睪丸體細(xì)胞中的功能 精子發(fā)生同樣依靠睪丸體細(xì)胞的參與，來源于支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞因子能夠調(diào)控精子發(fā)生過程。因此，miRNAs對睪丸體細(xì)胞的調(diào)控也可影響精子發(fā)生過程。有研究指出，激素可誘導(dǎo)支持細(xì)胞miRNAs的表達(dá)水平變化，從而改變支持細(xì)胞的狀態(tài)。例如雌二醇可誘導(dǎo)支持細(xì)胞miR-17和miR-1285的表達(dá)變化，從而調(diào)控支持細(xì)胞的增殖[30-31]。這種對于支持細(xì)胞增殖的調(diào)控也可通過miR-133b[32]和miR-762[33]的表達(dá)變化實(shí)現(xiàn)。睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要負(fù)責(zé)雄激素的生成，促黃體生成素（LH）誘導(dǎo)的雄激素生成過程會(huì)受到miRNAs的調(diào)控。miR-140-5p/3p能夠控制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，miR-140-5p/3p的缺失會(huì)導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加[34]。

總的來說，miRNA通過調(diào)控支持細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育與功能，為SSCs的自我更新和分化創(chuàng)造了一個(gè)合適的微環(huán)境，為SSCs提供了結(jié)構(gòu)以及營養(yǎng)支持。因此，睪丸體細(xì)胞中miRNAs同樣在精子發(fā)生過程中有著重要的作用。

3 總結(jié)與展望

精確而有效地調(diào)控基因表達(dá)是精子發(fā)生正常進(jìn)行的先決條件。研究證實(shí)，miRNAs在特定的細(xì)胞類型或精子發(fā)生階段中表達(dá)，然而其中大部分miRNAs在精子發(fā)生中的功能還未闡明。第一，將來的研究可借助單細(xì)胞測序的方法，可更為準(zhǔn)確地揭示特定生殖細(xì)胞類型中miRNAs的表達(dá)特點(diǎn)。條件性敲除技術(shù)以及CRISPR/Ca9技術(shù)的出現(xiàn)將能夠進(jìn)一步加快關(guān)于miRNAs功能的研究。第二，miRNAs在睪丸組織體細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)和作用還有待進(jìn)一步闡明。睪丸體細(xì)胞中的miRNAs能否以旁分泌的方式分泌到SSCs微環(huán)境中，miRNAs能否調(diào)控睪丸體細(xì)胞生長因子的分泌進(jìn)而影響生殖細(xì)胞發(fā)育，都需要進(jìn)一步探究。第三，轉(zhuǎn)錄因子既能夠調(diào)控SSCs的自我更新，也能夠調(diào)控SSCs的分化，然而miRNAs調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的作用機(jī)制還需更深入研究。第四，m6A能夠調(diào)控pri-miRNAs的加工，這為探究miRNAs生成調(diào)控和作用機(jī)制拓展了新的視野。在將來的研究中，探究生殖細(xì)胞發(fā)育中RNA表觀修飾的變化將為更深刻地理解精子發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。最后，一些miRNAs已經(jīng)被篩選為雄性不育的標(biāo)記分子，闡明不孕不育患者中miRNAs標(biāo)記分子的致病機(jī)理將有助于為男性不育提供新的療法?？傊?，揭示這些問題將有助于更為深刻地認(rèn)識(shí)和理解miRNAs在精子發(fā)生中的生物學(xué)作用。

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10.19556/j.0258-7033.2017-12-001

國家自然科學(xué)基金（31272439、31572401）

陳曉旭（1992- ）男，博士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：chenxiaoxu1992@outlook.com

*通訊作者：曾文先，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：zengwenxian2015@126.com