趙 亮， 官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科, 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004)

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·專題研究1·

AβOs對(duì)大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響*

趙 亮1,2， 官志忠2,3,4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 病理科, 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽 550004)

目的： 觀察β-淀粉樣蛋白寡聚體(AβOs)對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。方法： 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，用免疫熒光染色鑒定純度，制備并鑒定AβOs，用不同濃度AβOs(0.25、0.5、1及10 μmol/L)處理細(xì)胞48 h，采用CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活率，蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38磷酸化及總蛋白表達(dá)水平。結(jié)果： 免疫熒光染色結(jié)果顯示原代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)純度達(dá)85%以上；低于0.5 μmol/L AβOs對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞無明顯毒性作用，但可見phospho-ERK1/2 和phospho-JNK 蛋白表達(dá)升高；1 μmol/L及更高濃度的AβOs對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，同時(shí)可引起phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表達(dá)水平均降低，但總ERK1/2及總JNK蛋白表達(dá)水平未受明顯影響，而phospho-p38 及總p38蛋白表達(dá)水平與AβOs作用濃度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論： AβOs與MAPK信號(hào)通路之間的作用可因AβOs的作用濃度不同而出現(xiàn)差異。

阿爾茲海默病； β-淀粉樣蛋白寡聚體； 線粒體活化蛋白激酶通路； 原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞

阿爾茲海默病(alzheimer’s disease，AD)是老年性癡呆中最常見類型之一[1-2]，其組織病理學(xué)特征包括細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化的Tau蛋白組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)組成的老年斑(senile plaques，NPs)和神經(jīng)元選擇性丟失等[1]。越來越多的研究提示，在AD的致病因素中，大腦內(nèi)異常增多的可溶性β-淀粉樣蛋白寡聚體(β-Amyloid peptide oligomers，AβOs)較細(xì)胞外形成老年斑的Aβ更為重要[3-4]，并認(rèn)為其在AD早期的突觸丟失和認(rèn)知損害中扮演著重要的角色，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和凋亡有關(guān)[5]，并發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與AD的病理過程。研究顯示，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)可通過多種機(jī)制參與AD的發(fā)病過程，三種激酶主要為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase，ERKs或p42/44MAPK)、原癌基因c-Jun N末端蛋白激酶(JNKs/SAPK MAPK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過調(diào)節(jié)蛋白激酶活性，在淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)加工過程中發(fā)揮重要作用[6-7]；給小鼠海馬注射AβO(1-42)，可持續(xù)改變ERK/MAPK通路的活性，產(chǎn)生AD早期認(rèn)知損害[8]。研究顯示，Aβ能誘導(dǎo)p38 MAPK活化，通過Ca2+外流和非G蛋白相關(guān)機(jī)制，導(dǎo)致樹突棘丟失[9]。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度AβOs作用于大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，以期了解AβOs對(duì)MAPK各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

24 h內(nèi)新生SD乳鼠14只，體質(zhì)量5～10 g由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)SCXK，黔2012-0004)，研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NO 1311018)。多聚賴氨酸、Aβ1-42、六氟異丙醇等(美國(guó)Sigma)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(日本Dojindo)； SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天)；免疫組化檢測(cè)試劑盒(上?；?，山羊血清(中杉金橋)；Cruz Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)、抗小鼠IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)。兔抗phospho-p44/42和抗p44/42 MAPK單克隆抗體、U0126、兔抗phospho-SAPK/JNK MAPK和抗SAPK/JNK MAPK單克隆抗體、兔抗phospho-p38 MAPK和抗p38 MAPK單克隆抗體、抗兔IgG、蛋白酶/磷酸酶抑制劑(美國(guó)Cell Signaling公司)；BCA蛋白定量試劑盒、CY-3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體和488標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Thermo公司)；Neurobasal-A 培養(yǎng)基、DMEM-F12高糖培養(yǎng)基、Hibernate-E培養(yǎng)基、GlutaMAX添加劑、Novex 4-12% Bis-Tris預(yù)制膠、MES SDS電泳液(美國(guó)Life Technologies公司)；PVDF膜、ECL試劑盒(德國(guó)Merck Millipore公司)；兔抗GFAP單克隆抗體(丹麥Dako公司)；小鼠抗Aβ多克隆抗體6E10(美國(guó)Covance公司)，兔抗β-actin抗體(Abmart)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 (1)原代神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)，參考文獻(xiàn)[10-11]，將新生SD乳鼠用75%酒精浸泡消毒，無菌操作取大腦于預(yù)冷的Hibernate A培養(yǎng)基中。在解剖鏡下分離海馬，并去除腦膜及血管， 0.25% 胰蛋白酶37 ℃水浴消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM-F12種植培養(yǎng)基終止消化，用Neurobasal A/B27完全培養(yǎng)基(含有Neurobasal A培養(yǎng)基、2% B27、1% GlutaMAX添加劑、100 U/mL青霉素及100 g/L鏈霉素)吹散細(xì)胞，靜置后取上層細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×107個(gè)/L密度接種在經(jīng)左旋賴氨酸(PLL)包被過的6孔板或96孔板內(nèi)，于37 ℃，相對(duì)體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3 d以Neurobasal-A/B27完全培養(yǎng)基半量換液。(2)原代神經(jīng)細(xì)胞鑒定，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，用小鼠抗NeuN抗體(1∶50)及兔抗GFAP抗體(1∶200)，對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，以含有Cy3(紅光)標(biāo)記的抗小鼠IgG和488(綠光)標(biāo)記的抗兔IgG進(jìn)行染色，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，采集圖片，計(jì)數(shù)10個(gè)視野內(nèi)NeuN陽性及GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算原代神經(jīng)細(xì)胞的純度。

1.2.2 AβOs的制備與鑒定 (1)AβOs的制備，按文獻(xiàn)[12]中方法進(jìn)行制備。固體Aβ1-42多肽溶于六氟異丙醇(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)中，風(fēng)干后于-80 ℃保存。用前以DMSO和不含酚紅的DMEM-F12培養(yǎng)基稀釋，5 ℃孵育24 h，14 000 g冷凍離心10 min，取上清備用。(2)AβOs的鑒定，采用蛋白印跡法，將制備好的AβOs與含還原劑的上樣緩沖液混合后，70 ℃加熱10 min，以4%～12%的Bis-Tris預(yù)制膠電泳，孔徑0.22 μm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，小鼠抗Aβ 6E10抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記的抗小鼠IgG二抗孵育1 h，ECL發(fā)光試劑觀察表達(dá)情況。

1.2.3 細(xì)胞處理與指標(biāo)檢測(cè) 原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞接種至培養(yǎng)板培養(yǎng)10 d后，去B27培養(yǎng)2 h，加入不同濃度的AβOs(0.25、0.5、1及10 μmol/L)處理48 h后，進(jìn)行如下檢測(cè)。(1)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性。原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞以1×104個(gè)/孔濃度接種于96孔板中，不同濃度AβOs處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至計(jì)劃時(shí)間后，將每孔原始培養(yǎng)基取出，置換為不含血清及AβOs的純培養(yǎng)基100 μL，空白對(duì)照組加入100 μL無細(xì)胞純培養(yǎng)基，于每孔中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度[13]。(2)ERK1/2(p44/42)、JNK及p38 MAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的檢測(cè)蛋白印跡方法同前，用含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度，電泳后，轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜。封閉2 h，兔抗phospho-p44/42 MAPK(1∶1 000)、抗phospho-JNK MAPK(1∶1 000)、抗phospho-p38 MAPK(1∶1 000)抗體及兔抗p44/42 MAPK(1∶2 000)、抗JNK MAPK(1∶1 000)、抗p38 MAPK(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記的抗兔IgG(1∶5 000)孵育1 h，曝光方法同前，結(jié)果以β-actin蛋白條帶灰度值分別對(duì)phospho-p44/42、phospho-JNK、phospho-p38及總p44/42、總JNK、總p38進(jìn)行校準(zhǔn)，得到的phospho-p44/42、phospho-JNK、phospho-p38校準(zhǔn)值再與總p44/42、總JNK、總p38的校準(zhǔn)值相比，以所得比值統(tǒng)計(jì)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組蛋白磷酸化水平差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞純度鑒定

原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞相差顯微鏡下圖像如圖1A所示，經(jīng)NeuN和GFAP免疫熒光染色后，可見NeuN陽性細(xì)胞，即神經(jīng)細(xì)胞；激發(fā)后，細(xì)胞核顯紅色熒光(圖1B)；GFAP陽性細(xì)胞，即星形膠質(zhì)細(xì)胞，激發(fā)后，胞質(zhì)顯綠色熒光，胞核無色透明(圖1C)；未加抗體的陰性對(duì)照未觀察到熒光(圖1D)。計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)后，神經(jīng)細(xì)胞純度達(dá)到85%左右(圖1E)。

2.2 蛋白印跡方法鑒定Aβ1-42寡聚體

如圖2所示，Aβ1-42經(jīng)上述方法制備出多種寡聚體(二聚體、三聚體、四聚體、九聚體、十二聚體等)，同時(shí)，亦可見部分未聚合單體(4 kDa)存在。

2.3 AβOs細(xì)胞毒性試驗(yàn)

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，0.25、0.5、1及10 μmol/L AβOs分別作用于原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞48 h后，可見在1和10 μmol/L濃度作用下，神經(jīng)細(xì)胞存活率分別下降70%和50%，與未加AβOs組(Con組)相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05和P<0.01)。

2.4 AβOs對(duì)ERK1/2、JNK及p38 MAPK信號(hào)通路蛋白活化水平的影響

不同濃度AβOs(0.25、0.5、1和10 μmol/L)處理原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)在0.25和0.5 μmol/L AβOs作用下，phospho-ERK1/2(圖4A)和phospho-JNK(圖4B)蛋白表達(dá)水平均有升高趨勢(shì)，并分別在0.5 μmol/L和0.25 μmol/L時(shí)，

注：A為相差顯微鏡結(jié)果，B為NeuN染色，C為GFAP染色，D為只加二抗的對(duì)照結(jié)果，E為神經(jīng)細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞比例結(jié)果圖1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元免疫熒光染色(×200)Fig.1 Immunostaining of primary cultured neurons from the hippocampus of rat brains

圖2 Aβ1-42寡聚體蛋白水平Fig.2 The protein level of Oligomers of Aβ1-42

與Con組比較，(1)P<0.05;(2)P<0.01圖3 AβOs對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of AβOs on the survival rate of primary neurons

出現(xiàn)明顯差異，與對(duì)照組(Con)相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，而在1和10 μmol/L時(shí)，phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，總ERK1/2及總JNK蛋白表達(dá)水平無明顯變化；而phospho-p38(圖4C)蛋白表達(dá)水平與AβOs作用濃度呈負(fù)相關(guān)，從0.5 μmol/L開始出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，同時(shí)，總p38蛋白表達(dá)水平也有下降趨勢(shì)。

與Con組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01圖4 原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞phospho-ERK1/2、phospho-JNK和phospho-p38蛋白表達(dá)Fig.4 The protein level of phospho-ERK1/2, phospho-JNK and phospho-p38 in primary cultured neurons

3 討論

在AD的致病機(jī)制中，“淀粉樣級(jí)聯(lián)”假說認(rèn)為APP的異常代謝是引起Aβ堆積，老年斑形成等毒性作用的主要原因[1]，最初普遍認(rèn)為老年斑中僅僅是不可溶的纖維狀A(yù)β有神經(jīng)毒性作用，然而隨后的研究發(fā)現(xiàn)APP轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能異常、神經(jīng)元及突觸功能和結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在淀粉樣斑塊形成之前[14-15]。并且大量研究結(jié)果均提示，多種Aβ1-42寡聚體與非神經(jīng)元及神經(jīng)元細(xì)胞膜上的多種成分，包括脂類、離子通道、受體等相結(jié)合引起一系列復(fù)雜的突觸、神經(jīng)元和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能及結(jié)構(gòu)的異常，導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶等行為異常[16-18]。所以，目前普遍認(rèn)為，Aβ單體以及構(gòu)成老年斑的Aβ纖絲體并不是造成神經(jīng)毒性的主要Aβ形式，而可溶性寡聚Aβ才是產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要Aβ形式。越來越多的研究證實(shí)人和轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦組織中至少可以產(chǎn)生4種可以改變神經(jīng)元和認(rèn)知功能的可溶性Aβ寡聚體分子：二聚體、三聚體、Aβ*56和環(huán)狀原纖維，綜合目前的研究結(jié)果推測(cè)，這些寡聚體可能激活特定的信號(hào)通路，對(duì)神經(jīng)元突觸產(chǎn)生不同的毒性作用[19]。多項(xiàng)研究顯示，MAPK可通過多種機(jī)制參與AD的發(fā)病過程。已知Aβ42的聚合可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，產(chǎn)生活性氧和前炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α和白介素-1β等，二者均可刺激MAPK通路。同時(shí)，ERK信號(hào)通路與記憶功能有關(guān)，并可被Aβ活化[20]。有海馬薄片培養(yǎng)結(jié)果顯示，AβO(1-42)短時(shí)間作用不會(huì)活化JNK MAPK通路，而長(zhǎng)時(shí)間作用可以活化JNK MAPK通路，同時(shí)，下調(diào)ERK MAPK通路[21]。 還有研究認(rèn)為，p38 MAPK和ERK1/2有介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞Aβ1-42的作用，提示MAPK信號(hào)通路抑制劑可能通過降低大腦Aβ水平，成為AD的潛在治療靶標(biāo)[22]。不少實(shí)驗(yàn)結(jié)果為Aβ與MAPK信號(hào)通路之間的相互作用提供了證據(jù)，有趣的是，這些實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果卻并不一致，例如，Aβ對(duì)ERK MAPK信號(hào)通路的作用有時(shí)是活化，有時(shí)卻是抑制的。

為了進(jìn)一步明確二者之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以不同濃度AβOs作用于大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞毒性作用濃度的AβOs，可活化ERK1/2和JNK(P<0.05和P<0.01)，而在有細(xì)胞毒性作用濃度時(shí)，可抑制ERK1/2和JNK的活化(P<0.05和P<0.01)，同時(shí)，各濃度AβOs對(duì)總ERK1/2及總JNK蛋白表達(dá)水平無明顯改變；另外，還發(fā)現(xiàn)p38的活化水平與AβOs作用濃度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)，總p38蛋白表達(dá)水平在AβOs作用下也有下降趨勢(shì)。以上結(jié)果提示，AβOs與MAPK信號(hào)通路各種激酶之間的作用可因AβOs的作用濃度不同而出現(xiàn)差異，為我們以后選擇該通路作為治療靶標(biāo)提供了參考。

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(2016-10-28收稿，2016-12-05修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

Influence of β-amyloid Peptide Oligomers on Mitogen-activated Protein Kinases in Rat Hippocampal Primary Cultured Neuron

ZHAO Liang1,2, GUAN Zhizhong2,3,4

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,GuizhouMedicalUniversity,MinistryofEducation,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the influence of β-Amyloid peptide oligomers (AβOs) on mitogen-activated protein kinases (MARK) signal transduction pathways in primary cultured rat hippocampal neuron. Methods: The primary cultured neurons were isolated, and their purity was checked by immunostaining methods. The AβOs were prepared and identified. The primary cultured neurons were exposed to AβOs at different concentrations(0.25, 0.5, 1 and 10 μmol/L)for 48 h and the survival rate of cells was detected by CCK-8 test. Western blotting was adopted to detect total protein expression level of extracellular signal regulated protein kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38. Results: The results of immunostaining showed that the purity of primary cultured neurons was more than 85%. AβOs at the concentration of less than 0.5 μmol/L had no obvious toxic effect on primary cultured neurons, but prompted the protein expression increase of phospho-ERK1/2 and phospho-JNK. AβOs at the concentration ≥1.0 μmol/L had obvious toxic effect on primary cultured neurons and prompted the protein expression decrease of phospho-ERK1/2 and phospho-JNK, but had no obvious effect protein expression levels of pan-ERK1/2 and pan-JNK. The protein expression levels of phospho-p38 and pan-p38 were negatively correlated to AβOs concentration. Conclusions: The influence of AβOs on MAPK signaling pathway may be different according to different concentration of AβOs.

Alzheimer's disease; β-amyloid peptide oligomers; mitogen-activated protein kinases; primary cultured neurons

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260173)； 教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助”(IRT13058)； 貴州省科技計(jì)劃[黔科合重大專項(xiàng)字(2014)6008號(hào)]； 貴州省創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06]

時(shí)間：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.024.html

R749.16； R34-33

A

1000-2707(2016)12-1365-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.001

**通信作者 E-mail:1457658298@qq.com