黃海嬌 李慧玉 姜靜

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

BpAP1轉(zhuǎn)基因白樺中開花相關(guān)基因的時序表達1)

黃海嬌 李慧玉 姜靜

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

為揭示白樺(Betulaplatyphylla×B.pendula)中BpAP1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機理，以BpAP1過表達、抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟?NT)為試材，對前期獲得的BpAP1轉(zhuǎn)基因白樺中的6條開花相關(guān)基因(BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1和LFY)進行了定量PCR分析，探討了白樺BpAP1轉(zhuǎn)錄因子與這6條開花基因的表達調(diào)控關(guān)系以及它們對白樺提早開花的影響。結(jié)果表明：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ张cBpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺葉片中BpAP1、BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1和LFY的相對表達量在不同發(fā)育時期變化均不顯著。BpAP1過表達轉(zhuǎn)基因白樺葉片和雄花序中這7條基因的表達量在不同發(fā)育時期均顯著高于NT和BpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺。在BpAP1過表達轉(zhuǎn)基因白樺中，除BpAP1和TFL1外，其他5條基因在各個時期的雄花序中表達量均為最高，多數(shù)基因的表達高峰出現(xiàn)在6月15日；另外，BpAP1、BpMADS4、BpMADS5和BpPI在8月15日的雄花序中表達量也很高；TFL1的相對表達量在9月1日的葉片中顯著上調(diào)；LFY基因在生長發(fā)育最旺盛的6、7月份的雄花序中達到了表達高峰。BpAP1與BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1、LFY這6條開花相關(guān)基因之間均呈極顯著的正相關(guān)。

白樺；BpAP1；開花相關(guān)基因；表達特性；定量PCR

We used quantitative real-time PCR (qRT-PCR) of several flowering related genes inBpAP1 transgenic birch to study the regulation relationship between BpAP1 transcription factor and other six flowering related genes for revealing regulation mechanism of BpAP1 transcription factor. By qRT-PCR,BpAP1 overexpression lines,BpAP1 suppression lines and non-transgenic line (NT) were used to analyze the expression ofBpAP1,BpPI,BpMADS4,BpMADS5,FT,TFL1 andLFYat the eight developmental stages, and the correlation analysis were employed to reveal the regulation relationship betweenBpAP1 and other six flowering genes for their effect on early flowering in birch. There was no significant change in expression ofBpAP1,BpPI,BpMADS4,BpMADS5,FT,TFL1 andLFYin leaves of NT andBpAP1 suppression lines at different developmental stages. However, expression of these seven genes in leaves and male inflorescences ofBpAP1 overexpression lines was significantly higher than that in NT andBpAP1 suppression lines at different developmental stages.BpMADS4,BpMADS5,FT,BpPIandLFYall ectopically expressed in male inflorescences at the eight developmental stages, and the expression peak of most of genes appeared in 15th June. The expression ofBpAP1,BpMADS4,BpMADS5 andBpPIwas dramatically increased in male inflorescences in 15th August. Relative expression ofTFL1 was significantly upregulated in leaves in 1st September. Expression ofLFYin male inflorescences appeared peak in June and July. There is a significant positive correlation betweenBpAP1 andBpPI,BpMADS4,BpMADS5,FT,TFL1,LFY.

開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的一個重要轉(zhuǎn)折點，花的形成經(jīng)歷了一系列組織分化的過程，在這個過程中有諸多基因的參與，其中AP1基因編碼一個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，該基因在控制植物花分生組織特性與花器官的形成過程中起著至關(guān)重要的作用，是調(diào)控植物花發(fā)育的熱點基因之一[1-8]。人們最早研究MADS-box基因家族是通過擬南芥(Arabidopsisthaliana)、矮牽牛(Petuniahybrida)和金魚草(Antirrihiummajus)等經(jīng)典的模式植物進行的。根據(jù)MADS-box基因?qū)ㄆ鞴傩纬傻恼{(diào)控作用，提出了著名的花器官發(fā)育ABC模型，后經(jīng)補充發(fā)展成為ABCDE模型[9]，AP1基因是其中的A類基因。自ap1突變體的獲得和AP1基因的成功克隆以來[3,10]，研究者們對該基因進行了20多年的研究，特別是近些年來，隨著研究技術(shù)和研究手段的不斷更新和豐富，人們對AP1基因的研究更為系統(tǒng)，逐漸形成了一個以AP1基因為中心的成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

擬南芥中，AP1和LFY之間存在正反饋調(diào)節(jié)作用。在lfy突變體中，AP1的起始表達被推遲，說明LFY對AP1有正向調(diào)節(jié)作用，反過來，當(dāng)AP1基因過量表達時，LFY基因的表達會提前，表明AP1基因能夠正向調(diào)節(jié)LFY基因的表達[11-13]。另外，過量表達AP1基因能夠降低TFL1基因的表達。LFY基因和AP1基因之間正反饋調(diào)節(jié)的促進作用和TFL1對這兩條基因的抑制作用能夠共同作用于植物的成花誘導(dǎo)[11]。

AP1能夠正向調(diào)控PI和AP3的表達，以轉(zhuǎn)錄激活因子的方式?jīng)Q定花瓣特性[14-15]，反過來，PI能與AP3一起，直接結(jié)合到AP1的啟動子上，這表明AP1與PI之間的調(diào)控作用是直接的[16]。

歐洲白樺(Betulapendula)中有一些關(guān)于MADS-box基因的報道，BpMADS2，BpMADS4，BpMADS5和BpAP1同屬于白樺中的MADS-box基因，其中BpMADS2是PI的同源基因，該基因在雄花序中表達明顯，隨著雄花序的發(fā)育，其表達逐漸增強；雌花序中表達微弱甚至檢測不到[17]。BpMADS4、BpMADS5與擬南芥中的FUL基因序列相似，BpMADS4在花、芽和根中均有表達，其中花序分生組織起始的早期、頂端分生組織和幼嫩的苞片中均有很高的表達[18]，BpMADS4和BpMADS5在煙草(Nicotianatabacum)中過量表達均能使轉(zhuǎn)基因植株提前開花[19]，BpMADS4基因在蘋果(Maluspumila)中超量表達，也能使蘋果提前開花[20]。

本研究團隊前期獲得了BpAP1過表達和抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺[21-22]，對轉(zhuǎn)基因白樺組培苗中BpAP1基因及開花相關(guān)基因的表達情況進行研究發(fā)現(xiàn)，過表達株系中BpAP1基因的表達量顯著提高，且BpMADS4、BpMADS5和BpMADS8的表達量明顯提高，而在抑制表達株系中，除了BpMADS8外其他開花基因的表達量均降低，其中BpMADS1、BpMADS5、BpMADS6和BpMADS7最為明顯[23]。另外，對2年生過表達白樺和對照白樺中BpAP1基因的組織表達特異性進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在雄花序中的表達豐度顯著高于其他組織部位[21]。本研究在此基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果從開花網(wǎng)絡(luò)途徑中選取了3條與AP1關(guān)系比較緊密的3條基因LFY、FT、TFL1和3條AP1的同族基因BpPI、BpMADS4和BpMADS5(圖1)，以BpAP1過表達、BpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟鍨樵嚥?，對BpAP1基因和這6條開花相關(guān)基因在不同發(fā)育時期的表達情況進行了分析，探討白樺BpAP1轉(zhuǎn)錄因子與上述基因的調(diào)控關(guān)系，為揭示白樺BpAP1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2年生BpAP1過表達轉(zhuǎn)基因白樺(A2、A5株系)、BpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺(FA10、FA11株系)以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟?NT)。

1.2 取材方法

于2012年6月至9月每月初和每月中旬(6月1日，6月15日，…，9月15日)分別取BpAP1過表達轉(zhuǎn)基因白樺的葉片和雄花序、抑制表達白樺以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟宓娜~片為材料進行RNA的提取，葉片均為從植株頂端向下數(shù)第3或第4片葉，為剛剛完全展開的成熟葉片。

圖1 開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[24]

1.3 實時熒光定量PCR

采用CTAB法分別提取各個時期BpAP1過表達、抑制表達白樺以及NT的總RNA[25]，使用ReverTre Ace?qPCR RT Kit(Toyobo，Osaka，Japan)將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為,RNA 0.5 g，65 ℃變性5 min；加入4×DNA Master Mix 2 L，37 ℃反應(yīng)5 min；再加入5×RT Master Mix 2 L，使總體系為10 L。反應(yīng)程序為,37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作定量PCR的模板，以18SrRNA和α-Tubulin為內(nèi)參基因，對選取的開花基因進行定量驗證。PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 L(Toyobo，Osaka，Japan)、模板2 L、上游引物和下游引物(10 mol·L-1)各1 L、用去離子水補足體積20 L。反應(yīng)程序為,94 ℃ 30 s，94 ℃ 12 s、60 ℃ 1 min，循環(huán)45次，溫度由60 ℃開始至95 ℃終止，繪制熔解曲線。在ABI 7500實時定量PCR儀上完成qRT-PCR，重復(fù)3次，用2-ΔΔCt方法對定量結(jié)果進行分析[26]，引物序列見表1。

1.4 表達量的相關(guān)性分析

采用SPSS16.0對BpAP1基因及其他6個開花相關(guān)基因的表達量進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)以往研究者們在擬南芥中建立的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)基因白樺的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選取了BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1、LFY這6條開花相關(guān)基因以及BpAP1基因進行了8個不同發(fā)育時期的表達分析。

表1 qRT-PCR引物序列

2.1 BpAP1和6條開花相關(guān)基因的時序表達特性

分別以ds1時期非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟?NT)葉片中BpAP1、BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1和LFY基因的表達量為對照，對參試株系不同發(fā)育時期的葉片及雄花序中這7條基因的相對表達量進行比較。結(jié)果表明：NT與抑制表達白樺葉片中BpAP1基因的相對表達量在不同發(fā)育時期的變化不顯著，BpAP1相對表達量為0.048～20.46；而BpAP1過表達白樺的2個株系則不同，其葉片及雄花序中BpAP1基因的表達量各時期均顯著高于NT和BpAP1抑制表達白樺，并且該基因在不同發(fā)育時期的表達規(guī)律基本相同，其中A2株系的雄花序中BpAP1表達量在6月15日顯著上調(diào)，分別是NT和BpAP1抑制表達株系的1 406.28、1 491.88倍(圖2)。

NT.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟澹籄2、A5.BpAP1過表達轉(zhuǎn)基因白樺；FA10、FA11.BpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺；L.葉片；F.雄花序。

圖2BpAP1基因在不同發(fā)育時期的表達量

BpPI、BpMADS4、BpMADS5與BpAP1同屬于MADS-box基因家族中的成員，其中PI是開花ABC模型中的B類基因，主要控制花瓣和雄蕊的發(fā)育。從圖3A中可以看出：不同發(fā)育時期的NT、BpAP1抑制表達白樺與BpAP1過表達白樺葉片中BpPI的相對表達量(0.36～52.30)變化不顯著；而BpAP1過表達白樺雄花序中BpPI相對表達量各時期均顯著高于NT、BpAP1抑制表達白樺和BpAP1過表達白樺葉片(7月1日和8月1日除外)，并且BpAP1過表達白樺雄花序中BpPI的相對表達量在6月15日、8月15日和9月1日顯著上調(diào)，分別是NT的79.05、186.98、204.35倍。

BpMADS4和BpMADS5這2條基因的表達模式趨于一致：8個發(fā)育時期中NT與BpAP1抑制表達白樺葉片中BpMADS4和BpMADS5基因的相對表達量變化不顯著；而BpAP1過表達白樺雄花序中這2條基因的相對表達量均顯著高于NT和BpAP1抑制表達白樺(8月1日和9月15日除外)，且在6月15日，A2株系雄花序中這2條基因的相對表達量均達到最高，BpMADS4基因的表達量是NT的139.44倍；BpMADS5基因的表達量是NT的414.91倍(圖3B、C)。

NT與BpAP1抑制表達白樺葉片中FT、TFL1和LFY基因的相對表達量在不同發(fā)育時期的變化均不顯著，分別為0.69～69.79、0.46～9.70和0.33～15.51(圖3D、E、F)；而BpAP1過表達白樺葉片和雄花序中FT的相對表達量均顯著高于NT和BpAP1抑制表達白樺(8月1日除外)，并且在生長發(fā)育最旺盛的6月15日和7月15日出現(xiàn)表達高峰，在6月15日A2株系雄花序中FT的相對表達量最高，分別是NT和BpAP1抑制表達白樺中該基因表達量的630.51、617.71倍(圖3D)；A2株系葉片中TFL1的相對表達量在6月中旬和9月1日均顯著高于NT和BpAP1抑制表達株系，9月1日最為明顯，分別是NT和BpAP1抑制表達株系的39.67、13.78倍(圖3E)；BpAP1過表達白樺雄花序中LFY基因的相對表達量要高于NT和BpAP1抑制表達白樺(8月1日和9月15日除外)，其中A2株系雄花序中LFY基因的表達量在6月1日和9月1日顯著上調(diào)，分別是NT的32.53、10.71倍(圖3F)。

2.2 開花相關(guān)基因的表達相關(guān)性

BpAP1基因的過量表達引起了白樺的提早開花(圖4)[21]，為了更好地了解BpAP1基因與其他6條開花相關(guān)基因之間的關(guān)系，對這7條基因的相對表達量進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BpAP1與其他6條基因之間均呈極顯著的正相關(guān)，其中與FT基因的相關(guān)性最高(r=0.611；P<0.01；n=168)，說明BpAP1基因的過量表達提高了FT基因的表達量；另外，除BpMADS4與TFL1相關(guān)性不顯著，BpMADS5與TFL1、FT與LFY、TFL1與BpPI以及BpPI與LFY之間呈顯著的正相關(guān)以外，其他兩兩之間均呈極顯著的正相關(guān)，說明這些開花基因不僅與AP1之間存在著緊密的聯(lián)系，而且它們彼此之間也存在聯(lián)系，這些基因共同影響了白樺的提早開花(表2)。

NT.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟?；A2、A5.BpAP1過表達轉(zhuǎn)基因白樺；FA10、FA11.BpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺；L.葉片，F(xiàn).雄花序。

A.轉(zhuǎn)基因白樺組培瓶中開花；B.轉(zhuǎn)基因白樺移栽2個月后開出雄花；C.轉(zhuǎn)基因白樺的果穗；D.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟濉?/p>

開花相關(guān)基因BpAP1BpMADS4BpMADS5FTTFL1BpPILFYBpAP11．0000．594??0．565??0．611??0．431??0．399??0．601??BpMADS4─1．0000．844??0．419??0．1410．653??0．448??BpMADS5──1．0000．484??0．264?0．673??0．547??FT───1．0000．404??0．378??0．284?TFL1────1．0000．271?0．518??BpPI─────1．0000．292?LFY──────1．000

注：** 為0.01水平上極顯著相關(guān)；*為0.05水平上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對BpAP1以及BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1、LFY基因在BpAP1過表達、抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟逯械谋磉_情況進行分析，探討了這幾條基因之間的表達調(diào)控關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BpAP1過表達株系葉片和雄花序中這7條基因的表達量在不同發(fā)育時期均顯著高于NT和BpAP1抑制表達轉(zhuǎn)基因白樺，且BpAP1基因在各個時期過表達株系的葉片和雄花序中均處于高表達水平；除BpAP1和TFL1外，其他5條基因的表達高峰均出現(xiàn)在6月中旬的雄花序中；BpAP1基因與其他6條開花相關(guān)基因之間均呈極顯著的正相關(guān)?？傊珹P1基因的過量表達引起了白樺的提早開花，同時促使FT、PI、MADS4和MADS5基因的表達量在多數(shù)發(fā)育時期有著明顯地上調(diào)表達。

花序分生組織和花分生組織特異基因在木本植物中的研究很少，其中AP1、TFL1、LFY在果樹中有一些研究表明，AP1、LFY與開花呈正相關(guān)，而TFL1則與開花呈負(fù)相關(guān)[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達株系中AP1基因的表達量較NT有明顯地提高；過表達株系中LFY基因的表達量在大部分時期要高于NT和BpAP1抑制表達株系；TFL1基因的表達量除在9月初較NT和BpAP1抑制表達株系上調(diào)之外，其他時期的表達量變化均不顯著；因此認(rèn)為這些基因表達量的變化可能對于白樺在生長發(fā)育旺盛的6月至9月起到了重要的作用。

有很多研究表明，F(xiàn)T是一個能直接從葉片運送到莖尖的長距離蛋白[30]，它一般會通過與FD形成一個復(fù)合體在莖尖特異表達，同時也能激活下游的MADS-box基因，如AP1[31-32]。有研究表明，F(xiàn)T基因的過量表達能夠促進擬南芥提早開花[33]。BpAP1過表達株系中FT基因的表達發(fā)生了明顯的上調(diào)，而BpAP1抑制表達株系中FT的表達量則明顯下降，這表明AP1雖然位于FT的下游，但該基因在白樺中的過量表達對于FT可能也會有影響，因此認(rèn)為二者的高表達都可能縮短白樺的童期，引起早花現(xiàn)象。

PISTILLATA是ABC模型中的B類基因，在擬南芥中主要控制花瓣和雌蕊的發(fā)育；玉米中的PI基因在種子、葉片和根中均有表達[34]；而葡萄中的PI基因在不同發(fā)育時期的花序中均有表達，但果實、根和葉片中檢測不到該基因的表達，定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄花序中PI基因的表達量很高，是葉片和根中表達量的400倍[35]；BpMADS2在歐洲白樺雄花序中表達明顯，隨著雄花序的發(fā)育，BpMADS2的表達逐漸增強，雌花序中表達很弱甚至檢測不到[17]。本研究對BpPI基因進行表達分析發(fā)現(xiàn)，該基因在白樺生長發(fā)育的8個時期中雄花序中表達量均為最高(圖2B)；雌、雄花序發(fā)育的3個時期中，BpAP1過表達白樺中BpPI的表達量高于相應(yīng)時期WT中該基因的表達量[22]，這表明BpPI基因是花器官特征基因，能夠控制白樺雄蕊的發(fā)育。

盡管人們對花的形態(tài)結(jié)構(gòu)和建成有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識，但對植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變機理認(rèn)識還很少，尤其是木本植物，開花過程中基因間的相互關(guān)系很多還僅僅基于遺傳學(xué)的假設(shè)。本研究主要對BpAP1基因和BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1、LFY這6條開花相關(guān)基因在不同發(fā)育時期的表達情況進行了分析，探討白樺BpAP1轉(zhuǎn)錄因子與上述基因的調(diào)控關(guān)系，為揭示白樺BpAP1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機理提供參考。當(dāng)然，植物生長發(fā)育過程中涉及到的代謝途徑和基因之間的關(guān)系是極其復(fù)雜的，后續(xù)將采用CHIP技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對BpAP1轉(zhuǎn)基因白樺進行研究，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進一步了解AP1基因的功能。

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Quantitative Expression Analysis of Several Flowering-related Genes inBpAP1 Transgenic Birch (Betulaplatyphylla×Betulapendula)//

Huang Haijiao, Li Huiyu, Jiang Jing

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：1-6.

Birch;BpAP1; Flowering-related genes; Expression pattern; qRT-PCR

1)國家自然科學(xué)基金項目(31570647)。

黃海嬌，女，1985年10月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，工程師。E-mail：haijiao_sea@163.com。

姜靜，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail：jiangjing1960@126.com。

2016年11月3日。

S792.153；Q344+.13

責(zé)任編輯：程 紅。