張衡鋒 韋慶翠

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州，225300)

張煥朝

(南京林業(yè)大學(xué))

番紅花花芽分化期顯微結(jié)構(gòu)及核酸、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化1)

張衡鋒 韋慶翠

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州，225300)

張煥朝

(南京林業(yè)大學(xué))

運(yùn)用掃描電鏡技術(shù)觀察番紅花(CrocussativusL.)花芽不同分化期的形態(tài)變化，測定不同分化及發(fā)育期的核酸和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并分析了核酸與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的相關(guān)性。結(jié)果表明：番紅花花器官按照萼片—外輪花被—雄蕊—內(nèi)輪花被—雌蕊的順序分化，蝎尾狀聚傘花序，從花芽分化開始到花器官功能形成共經(jīng)歷65 d左右；番紅花花芽分化過程中，RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后降低，DAN、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)“升-降-升”的變化趨勢，核酸與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在顯著或極顯著相關(guān)性。由此說明，番紅花屬于典型的ABC植物，核酸和蛋白質(zhì)代謝共同調(diào)節(jié)番紅花花芽的分化和發(fā)育，是營養(yǎng)生長過渡為生殖生長及花芽形態(tài)建成的生化基礎(chǔ)。

番紅花； 花芽分化； 顯微結(jié)構(gòu)； 核酸； 可溶性蛋白

Scanning electron microscope was applied to observe the formal change ofCrocussativusL. during its different flower bud differentiation stages, measure the contents of nuclein acid and soluble protein in differential growth periods, and study the co-relation between them. The differentiation sequence of its flower organ as follows: sepals outer tepals stamens inner tepals pistils, as for scorpioid cyme, it took about 65 d from the beginning of flower bud differentiation to the formation of floral organ. During the flower bud differentiation process, the contents of RNA/DNA and RNA were increased firstly, and then decreased, and those of DNA and soluble protein presented a “up-down-up” trend, and there was a significant or highly significant correlation between the contents of nucleic acid and soluble protein. Thus,C.sativusL was a typical ABC plant, and nucleic acid and protein metabolism commonly regulated the differentiation and development of flower bud, and was the biochemical basis of the transition from vegetative growth to reproductive growth and flower bud morphogenesis.

番紅花(C.sativus)屬鳶尾科番紅花屬多年生三倍體鱗莖類球根花卉，近年來，因其巨大藥用開發(fā)潛力和較高的園林觀賞價(jià)值，已成為植物學(xué)界的研究熱點(diǎn)。番紅花原產(chǎn)于伊朗、小亞細(xì)亞半島和希臘等地[1]，引種到中國后，由于對其開花規(guī)律不了解和對本土栽培技術(shù)研究不深入，與原產(chǎn)地相比，中國番紅花生產(chǎn)上存在花數(shù)量少，種球退化，病害頻發(fā)，花期過于集中等癥結(jié)[2-6]，而這些問題均與番紅花的開花機(jī)制及營養(yǎng)代謝密切相關(guān)。本研究首次在里下河平原水網(wǎng)地區(qū)引種番紅花，以花芽分化生理生化機(jī)制為切入點(diǎn)，通過電鏡觀察番紅花花芽分化的形態(tài)變化過程，測定花芽分化及發(fā)育過程中核酸和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的動(dòng)態(tài)變化，揭示了番紅花花芽分化的形態(tài)和生理變化規(guī)律，為中國番紅花產(chǎn)業(yè)高效健康發(fā)展提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2013年引種到泰州的番紅花(CrocussativusL.)組培種球，種植于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院校內(nèi)實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)(32°27′42″N,119°55′57″E)。泰州地區(qū)年降水量1 020.5 mm，全年最高、最低和平均溫度分別為38.2、-7.2、14.9 ℃，全年光照時(shí)間1 746 h。2013年12月5日大田定植，正常水肥管理，2014年5月1日收獲仔球并儲(chǔ)藏于陰涼通風(fēng)處備試。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2014年7月10日挑選500枚生長完好，質(zhì)量為(25±1)g的種球置于溫度25 ℃、濕度75%、光照0 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)花芽長至7 cm左右時(shí)每7 d增加300 lx，21 d后達(dá)到最大值1 200 lx，在此光照強(qiáng)度下花朵全部開放。自2014年7月20日開始每3 d取樣1次，在體視顯微鏡下解剖、觀察，發(fā)現(xiàn)花芽分化后每天取樣1次(以第一小花分化為準(zhǔn)，樣品大小為5 mm×5 mm×7 mm)，并立即將花芽置于FAA固定液(V(福爾馬林)∶V(冰醋酸)∶V(乙醇)=5∶5∶90)中固定保存，直至花芽分化完成，以備電鏡觀察、拍照。同時(shí)，根據(jù)花芽分化及發(fā)育各時(shí)期不同形態(tài)特征，將整個(gè)分化及發(fā)育過程分為6個(gè)關(guān)鍵階段：營養(yǎng)生長期(VP)、花序原基和小花原基分化期(FP)、雄蕊原基分化期(SP)、雌蕊原基分化期(PP)、花芽發(fā)育期(DP)和盛花期(MP),并分別取樣。分別挑選15枚正常的球莖，剝?nèi)[片，洗凈、吸干，對花芽進(jìn)行取樣、稱量(圖1)，重復(fù)3次，將稱好的樣品立即液氮冷凍處理，并于冰箱中-76 ℃超低溫保存，以備生理生化指標(biāo)的測定。

A.帶鱗片球莖；B.無鱗片球莖；C.球莖橫切面；D.取樣樣品；圖中方框標(biāo)注花芽取樣區(qū)。

1.3 測定方法

掃描電鏡觀察、拍照參照李和平[7]和常鐘陽等[8]的方法，并根據(jù)番紅花花芽特性適當(dāng)調(diào)整；核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參照朱廣廉等[9]的方法，總核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用紫外吸收法測定，DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用二苯胺法測定；可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參照李合生[10]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制表，并用DPS9.50軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性檢驗(yàn)(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花芽分化解剖結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)番紅花花芽分化先后順序和分化特征，將其整個(gè)分化過程劃分為6個(gè)關(guān)鍵階段。

營養(yǎng)生長期：生長點(diǎn)保持營養(yǎng)生長狀態(tài)，生長點(diǎn)呈半球形，生長錐寬度大于高度。隨著生長錐的生長和分化，葉原基開始形成，并包被生長錐。隨著葉原基分化的深入，在生長錐基部陸續(xù)分化出螺旋狀著生的幼葉(圖2A)，該階段歷時(shí)約30 d。

花序原基和小花原基分化期：7月下旬，植物莖端由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變。生長錐迅速伸長，長度可達(dá)2～3 mm，呈鈍圓錐形，原先光滑的表面開始分化成許多球狀的原基突起，這些突起即為花序原基；第一苞片(遠(yuǎn)軸)幾乎與小花原基同時(shí)發(fā)生(圖2B)，隨著分化的深入，第一苞片向上生長，并將大部分小花花序原基包裹；小花原基進(jìn)一步分化出第二苞片(近軸)，與第一苞片對生，基部始終被第一苞片包裹；第二苞片分化過程中，在第一小花原基下方分化出第二小花原基；一般花序原基只分化出2個(gè)小花原基，第三小花原基罕見(圖2C)，該階段歷時(shí)約10 d。

外輪花被原基分化期：小花原基表面出現(xiàn)3個(gè)突起，呈等邊三角形分布，將小花原基三等分，這3個(gè)突起即為外輪花被原基。隨著分化的深入，3個(gè)外輪花被原基逐漸分化出外輪花被，呈長三角形，內(nèi)彎(圖2D)。

雄蕊原基分化期：在外輪花被的內(nèi)側(cè)順時(shí)針分化出3個(gè)突起，即雄蕊原基，亦呈三角形分布。隨著分化的深入，雄蕊原基迅速伸出、加寬，頂面觀呈圓形，在發(fā)育中后期，雄蕊呈現(xiàn)舌狀，外側(cè)面內(nèi)陷，超出花被片的包裹，花藥結(jié)構(gòu)逐漸形成(圖2,E-G)。

內(nèi)輪花被原基分化期：雄蕊原基形成后，在兩個(gè)外輪花被原基之間近軸處，順時(shí)針分化出內(nèi)輪花被原基，與外輪花被形成對生。隨著分化的深入，逐漸長成與外輪花被一般大小(圖2H)。外輪花被原基、雄蕊原基和內(nèi)輪花被原基分化間隔極短，3個(gè)階段前后歷時(shí)3～5 d。

雌蕊原基分化期：在雄蕊原基內(nèi)側(cè)出現(xiàn)3枚雌蕊原基，亦呈等邊三角形分布，當(dāng)雄蕊呈現(xiàn)舌狀狀態(tài)時(shí)，雌蕊原基生長點(diǎn)出現(xiàn)3個(gè)突起，形態(tài)上呈現(xiàn)舌狀結(jié)構(gòu)，隨著分化深入，雌蕊原基分化出3枚心皮原基，且具有心皮腹溝(圖2I)；3心皮頂端逐漸靠攏，腹縫線不斷內(nèi)卷、閉合形成子房；子房內(nèi)部分化出胚珠；在子房頂端3心皮共同分化出花柱(圖2J-K)；花柱向上生長，頂端橫向擴(kuò)展，分化出3裂柱頭(圖2L)。雌蕊原基分化與內(nèi)輪花被原基分化間隔期較長，從發(fā)現(xiàn)內(nèi)輪花被原基到發(fā)現(xiàn)雌蕊原基歷時(shí)20～25 d。

BP.苞片原基;Br.苞片;Ca.心皮;F.葉;FF.第一小花原基;GC.營養(yǎng)生長錐;Ov.子房;Ou.胚珠;PP.雌蕊原基;RC.生殖生長錐;SF.第二小花原基;SP.雄蕊原基;St.柱頭;T.外輪花被原基;t.內(nèi)輪花被原基。

圖2 番紅花花芽分化解剖結(jié)構(gòu)觀察

2.2 不同分化及發(fā)育期核酸、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

2.2.1 核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

按照細(xì)胞全能性理論，植物花芽在進(jìn)行分化之前，分化的所有步驟已在花芽莖尖分生細(xì)胞中預(yù)先編入程序，分化的過程實(shí)際上就是成花基因阻遏不斷解除的過程[11]，所以，研究核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對番紅花花芽分化至關(guān)重要(表1)，在番紅花花芽分化及發(fā)育過程中，花芽中核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生了極顯著變化。RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，在花芽發(fā)育期達(dá)到最高值1 875.14 μg·g-1，是營養(yǎng)生長期的4.58倍；DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈現(xiàn)出升高-降低-升高的變化趨勢。同樣，花芽中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)也發(fā)生了顯著變化，也呈現(xiàn)出先升高后降低變化趨勢，且各個(gè)時(shí)期RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間均存在極顯著差異，最高值出現(xiàn)在雌蕊原基分化期。

表1 不同發(fā)育階段花芽中核酸、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

注：表中數(shù)據(jù)根據(jù)花芽鮮質(zhì)量測得；同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著；同列不同大寫字母表示在0.01水平上差異極顯著。

2.2.2 可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

可溶性蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白，在植物花芽分化過程中需求量較大，是花器官形態(tài)建成的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[12]。花芽分化啟動(dòng)后，存儲(chǔ)在鱗莖中的非可溶性蛋白經(jīng)酶水解形成氨基酸，并輸送到旺盛生長部位加以利用(表1)，在番紅花花芽分化及發(fā)育過程中，花芽中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)出升高-降低-升高的變化趨勢，且各時(shí)期間均存在極顯著差異，最大值出現(xiàn)在花序及小花原基分化期，最小值出現(xiàn)在雄蕊分化期。

2.2.3 核酸與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性分析

通過相關(guān)性分析表明(表2)，番紅花花芽中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別與RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)、DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在顯著負(fù)相關(guān)性；DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在極顯著正相關(guān)性。

表2 番紅花花芽分化及發(fā)育過程中核酸與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)分析

相關(guān)因子RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)1．000DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)-0．5871．000RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)-0．876?-0．866?1．000可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)-0．5200．939??-0．842?1．000

注：** 表示差異極顯著(p<0.01)；*表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論與討論

花序是植物系統(tǒng)分類學(xué)的關(guān)鍵依據(jù)。鳶尾科植物花序類型多為穗狀花序等無限花序，但根據(jù)對番紅花花序結(jié)構(gòu)和開花順序分析，番紅花應(yīng)屬于有限花序中的蝎尾狀聚傘花序。番紅花從花芽分化開始到花器官功能形成共經(jīng)歷65 d左右，其花器官按照萼片—外輪花被—雄蕊—內(nèi)輪花被—雌蕊的順序分化，并未按傳統(tǒng)花芽分化模式進(jìn)行分化，這種現(xiàn)象在德國鳶尾中也有發(fā)生[8]。另外，番紅花外輪花被和雄蕊是由同一塊原基分化而來，在單子葉植物中，這種花被雄蕊同原基分化、花被原基和雄蕊原基融合和花被雄蕊形成復(fù)合共同體現(xiàn)象普遍存在[13]，這可能是番紅花雄蕊原基早于內(nèi)輪花被原基分化的重要原因，同時(shí)，也從一個(gè)側(cè)面反映出番紅花仍保留一些原始的分化模式，是一種進(jìn)化不完全的表現(xiàn)。一般情況下，單子葉植物橫切面平面圖應(yīng)為三基數(shù)五環(huán)結(jié)構(gòu)[13]，但番紅花與其余鳶尾科植物類似，只有3枚雄蕊，喪失1個(gè)雄蕊環(huán)，但這并沒有影響中心環(huán)心皮的分化和位置，仍然具有單子葉植物的3基數(shù)結(jié)構(gòu)特征，并同樣形成花被環(huán)、雄蕊環(huán)和心皮環(huán)，仍屬于典型的ABC植物。

番紅花花芽分化及發(fā)育過程中，花芽中RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈現(xiàn)先升高后降低變化趨勢，而DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻呈現(xiàn)升高-降低-升高的變化趨勢，與李月華等[14]和張荻等[15]研究結(jié)果類似，這種差異表現(xiàn)可能是因?yàn)榛ㄑ壳o端分生組織接受到成花信息誘導(dǎo)后，RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始上升，隨后與花原基細(xì)胞增殖有關(guān)的DNA開始復(fù)制，DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速上升，進(jìn)入基因轉(zhuǎn)錄程序后，需要大量的mRNA、tRNA和rRNA，致使RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)上升，DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。隨著花芽分化的結(jié)束，作為轉(zhuǎn)錄因子的RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，但與花芽發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞增殖仍在繼續(xù)，所以DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)又上升?；ㄑ績?nèi)RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)從花序及小花原基分化期開始急劇升高，說明番紅花花芽在生殖生長期發(fā)生大量誘導(dǎo)基因的表達(dá)，而且高RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)利于營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變，這可能與花原基形成需要大量特異性mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)(尤其是酶)合成有關(guān)[16]。番紅花花芽分化及發(fā)育過程中，大量的DNA復(fù)制和大量mRNA轉(zhuǎn)錄，必然誘導(dǎo)大量蛋白質(zhì)合成，RNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的顯著相關(guān)性證實(shí)了這一點(diǎn)。另外，在雄蕊原基分化期可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)一個(gè)低谷，這可能與雄蕊原基和小花原基由同一塊原基發(fā)育而來有關(guān)。

核酸和蛋白質(zhì)代謝是番紅花花芽從營養(yǎng)生長過渡為生殖生長及花芽形態(tài)建成的生化基礎(chǔ)，核酸和蛋白的組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)共同調(diào)節(jié)番紅花花芽的分化及發(fā)育，進(jìn)一步探索核酸和蛋白質(zhì)組分及關(guān)鍵特異蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化對明確番紅花花芽分化分子調(diào)控機(jī)制具有開創(chuàng)性意義。

[1] CAIOLA M G, CAPUTO P, ZANIER R. RAPD analysis inCrocussaivusL. accessions and relatedCrocusspecies[J]. Biology Plantarum,2004,48(3):375-380.

[2] 繞君鳳,王根法,呂偉德.浙江省西紅花“二段法”優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(9):5214-5215.

[3] 李云飛,張正偉,呂志剛.種植密度對藏紅花生長的影響[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,13(7):12-13.

[4] 董衛(wèi)明.番紅花種球定量留芽增產(chǎn)效果研究簡報(bào)[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,28(1):131-133.

[5] 劉蕓,朱利泉,龍?jiān)?等.鉀對番紅花球莖膨大的促進(jìn)效應(yīng)[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào),2004,10(1):96-100.

[6] 謝禮,呂明芳,董峰麗,等.藏紅花病毒病原的分子鑒定[J].中草藥,2013,44(8):1033-1036.

[7] 李和平.植物顯微技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2009:85-90.

[8] 常鐘陽,張金政,孫國鋒,等.德國鳶尾‘常春黃’花芽分化的形態(tài)觀察及兩種代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化[J].植物研究,2008,28(6):741-745.

[9] 朱廣廉,鐘海文,張愛琴.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:北京大學(xué)出版社,1990:135-138.

[10] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,1999:195-196.

[11] 曹宗巽,吳相鈺.植物生理學(xué)：下冊[M].北京:人民教育出版社,1980:399-400.

[12] 涂淑萍,穆鼎,劉春.不同百合品種花芽分化期的生理生化變化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,21(7):207-209.

[13] REMIZOWA M V, SOKOLOFF D D, RUDALL P J. Evolutionary history of the monocot flower[J]. Annals of the Missouri Botanical Garden,2010,97(4):617-645.

[14] 李月華,劉建斌,高潤清,等.華北紫丁香花芽生長過程中蛋白質(zhì)和核酸含量變化研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,15(2):24-27.

[15] 張荻,申曉輝,卓麗環(huán).百子蓮(Agapanthuspraecoxssp.orientalis)開花生理特征的研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2011,29(3):6-13.

[16] TAO Y L, ZENG G W, ZHU C. The studies on the formation and timing of evocation cell group of floral primordia and its histochemistry in Cucumber[J]. Journal Zhejiang University (Agriculture & Life Sciences),2001,27(2):134-138.

Contents of Microscopic Structure, Nucleic Acid and Soluble Protein during Flower Bud Differentiation inCrocussativus//

Zhang Hengfeng, Wei Qingcui

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College);

Zhang Huanchao

(Nanjing Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：33-36.

Crocussativus; Flower bud differentiation; Microscopic structure; Nucleic acid; Soluble protein

張衡鋒，男，1980年7月生，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院園林園藝系，講師。E-mail:584189434@qq.com。

張煥朝，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:hczhang@njfu.edu.cn。

2016年9月16日。

S682.29；Q942.5

1)泰州市科技支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(TN201321)、江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目( LYSX[2014]13)。

責(zé)任編輯：任 俐。