盧東升 侯志杰 王婷敏

(信陽師范學院,信陽，464000)

梅花內(nèi)生真菌及其多樣性1)

盧東升 侯志杰 王婷敏

(信陽師范學院,信陽，464000)

通過采樣、組織分離、培養(yǎng)與鑒定，對梅花內(nèi)生真菌種類、分布及多樣性進行了初步研究。結(jié)果表明：梅花內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性，共得到梅花內(nèi)生真菌15種。其中產(chǎn)孢真菌8屬12種，非產(chǎn)孢真菌3種。它們多數(shù)為半知菌，少數(shù)為接合菌，曲霉1(Aspergillussp.1)和青霉1(Penicilliumsp.1)是梅花內(nèi)生真菌優(yōu)勢種。梅花內(nèi)生真菌廣泛分布于各種組織內(nèi)，總定殖率為54.8%，在嫩枝木質(zhì)部定殖率最高，達65.6%。梅花植物體外部生態(tài)環(huán)境及內(nèi)部組織類型對內(nèi)生真菌的種類與分布均有重要影響。

梅花；內(nèi)生真菌；多樣性

The species, distribution and diversity of endophytic fungi inPronusmumeplants were studied by sampling, tissue isolation, culture and identification. The endophytic fungi were rich in biological diversity, and total of 15 species of endophytic fungi were obtained. Among them, the 12 species belonging to 8 genera were sporulation fungi, and 3 species were non-sporulation fungi. The most fungi were belonging to Deuteromycete, and a few were zygomycete. TheAspergillussp.1 andPenicilliumsp.1 were dominant species of endophytic fungi fromPronusmumeplants. The endophytic fungi ofPronusmumewere widely distributed in various tissues. Their total colonization rate was 54.8%. The fungus colonization rate in xylem of the tender branch was highest of 65.6%. The ecological environment and the internal organization type ofPronusmumeplants had important effects on the species and distribution of endophytic fungi.

梅花(Pronusmume)屬薔薇科(Rosaceae)李屬植物，是我國傳統(tǒng)名花，位居十大名花之首。其色、香、姿、韻俱佳，且花期早，花期長，品種類型多樣，栽培容易，受到廣大人民群眾喜愛。人們對梅花形態(tài)、生理、品種分類、栽培及病蟲害防治等方面研究較多[1-7]，但有關(guān)其內(nèi)生真菌的研究未見報道。內(nèi)生真菌是棲居于健康植物組織內(nèi)的真菌種類，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌普遍存在于各種植物體內(nèi)，對宿主植物生長發(fā)育和抗逆性均有重要影響[8-10]。因此，開展內(nèi)生真菌調(diào)查研究對于植物的栽培、病蟲害防治等具有重要意義。文中于2016年7—8月份，通過組織分離，培養(yǎng)觀察與鑒定，對梅花內(nèi)生真菌的種類、形態(tài)、分布及多樣性進行了初步研究，旨在為梅花內(nèi)生真菌的深入研究及資源利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標樣采集

依據(jù)梅花生境的不同，在河南省信陽市設置了6個樣地。梅花各樣地位置及生境狀況見表1。分別在各樣地采集當年生健康嫩枝、老枝各10枝(長約15 cm)，葉30片。材料分別裝入無菌塑料袋內(nèi)，編號后帶回實驗室待用。

1.2 內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)與鑒定

采集的標樣當天進行內(nèi)生真菌分離[11-13]。先將梅花老枝、嫩枝流水沖洗去表面雜物，然后將其切為長約3 cm的短段，分別放入250 mL無菌三角瓶中。無菌條件下，依次用75%乙醇、4%次氯酸鈉、75%乙醇分別消毒2、10、1 min。各消毒劑之間用無菌水沖洗3次。之后從三角瓶中取出材料，將嫩枝及老枝橫切為0.5 cm段，再縱剖為4等分，將皮部與木質(zhì)部分開。葉器官流水沖洗后先整體消毒，消毒方法與枝相同，然后將葉柄、葉基、葉中、葉尖部分分離，葉柄切為0.3 cm長的段，葉片各部分切為邊長0.5 cm的方塊，最后分別將嫩枝和老枝皮部、木質(zhì)部、葉柄、葉基、葉中、葉尖等不同組織塊接入PSA平板培養(yǎng)基，每皿接組織6塊。將接種后的平皿放入恒溫箱中28 ℃培養(yǎng)。當組織塊出現(xiàn)菌落后，挑取不同真菌菌落前沿菌絲進行轉(zhuǎn)管純化，再將純化后的真菌轉(zhuǎn)接入PSA平板培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)，觀察菌落的外部特征并觀測菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子等顯微形態(tài)，照相記錄，依據(jù)相關(guān)文獻[14-18]對內(nèi)生真菌進行鑒定。

1.3 內(nèi)生真菌相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

梅花內(nèi)生真菌的定殖率、分離率、多樣性指數(shù)及相似系數(shù)按文獻[19]方法進行計算。聚類分析采用SPSS 19統(tǒng)計軟件，以不同組織、不同樣地內(nèi)生真菌的豐度、種類組成及定殖率建立數(shù)據(jù)庫，通過系統(tǒng)聚類，按組間聯(lián)接方法計算區(qū)間平方歐氏距離，構(gòu)建聚類樹形圖。

表1 梅花樣地位置及生境

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花內(nèi)生真菌的種類組成及分布

經(jīng)研究，梅花內(nèi)生真菌種類豐富，分布普遍。在供試的梅花各樣地、各種組織內(nèi)均有內(nèi)生真菌定殖。本試驗共取梅花組織1 179塊，經(jīng)培養(yǎng)有646塊組織得到真菌，內(nèi)生真菌定殖率達54.8%。經(jīng)統(tǒng)計，真菌在梅花老枝皮部、老枝木質(zhì)部、新枝皮部、新枝木質(zhì)部、葉柄、葉基、葉中、葉尖等組織的定殖率分別為42.0%、59.4%、38.4%、65.6%、63.8%、62.7%、52.3%、54.5%。由此可看出，梅花枝器官，以新枝木質(zhì)部內(nèi)生真菌定殖率最高，達65.6%。葉器官，以葉柄內(nèi)生真菌定殖率最高，達63.8%。另外，不同樣地同一類型梅花組織內(nèi)生真菌的定殖率也有明顯差別(表2)。因此，梅花內(nèi)生真菌的分布，即與組織內(nèi)環(huán)境相關(guān)，也與宿主生境有密切聯(lián)系。

表2 梅花內(nèi)生真菌的定殖率及多樣性指數(shù)

樣地多樣性指數(shù)嫩枝皮部嫩枝木質(zhì)部老枝皮部老枝木質(zhì)部葉柄葉基葉中葉尖總體SY10．750．691．040．820．490．680．520．570．98SY20．380．530．680．500．891．300．991．151．24SY30．680．800．680．630．670．720．670．700．74SH0．610．710．780．700．680．680．640．710．76NW0．470．880．611．031．030．911．181．331．34BHY0．730．490．501．040．620．990．860．731．02

本研究共得到內(nèi)生真菌722株。其中，產(chǎn)孢真菌652株，未產(chǎn)孢真菌70株，未產(chǎn)孢真菌占內(nèi)生真菌總菌株數(shù)的9.7%。經(jīng)觀察和測定，依據(jù)其菌落、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)等特征進行鑒定，結(jié)果表明，產(chǎn)孢真菌有8屬12種，未產(chǎn)孢真菌有3種。產(chǎn)孢真菌大多數(shù)為半知菌，少數(shù)為接合菌。在梅花內(nèi)生真菌中，以曲霉1和青霉1分布最為廣泛，在供試的梅花各個樣地各種組織中均可分離到，而且分離率較高，分別為16.0%～41.0%和25.3%～39.1%(表3)。因此，曲霉1和青霉1是梅花優(yōu)勢內(nèi)生真菌。另外，曲霉2和曲霉3僅分布于老枝皮部，曲霉4僅分布于嫩枝皮部，毛霉僅分布于嫩枝木質(zhì)部。說明這些真菌分布具有組織專一性。

2.2 梅花內(nèi)生真菌的多樣性與相似性

不同梅花樣地之間內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別，樣地SY1、SY2、SY3、SH、NW、BHY梅花內(nèi)生真菌分別有8、4、3、2、10、9種。由此可看出，樣地NW梅花內(nèi)生真菌種類最豐富，為10種，真菌多樣性指數(shù)達1.34；樣地SH最少，僅2種，真菌多樣性指數(shù)為0.76(表2)。不同樣地梅花內(nèi)生真菌的相似系數(shù)見表4，由表4可看出，梅花生境中的光照與濕度等生態(tài)條件越相似，內(nèi)生真菌相似性也越大，反之亦反。如樣地SH與SY3光照條件相似，SY3梅花栽培在建筑物旁草坪背陰處，SH靠近水塘，濕度均較大，兩地梅花內(nèi)生真菌相似系數(shù)達0.800；樣地SY1與SY3梅花生境差異較大，樣地SY1梅花栽培于花壇內(nèi)，陽光充足，樣地SY3梅花栽培于建筑物北面背陰處，兩地內(nèi)生真菌相似系數(shù)僅為0.333。

表3 梅花內(nèi)生真菌的分離率及分布

表4 不同樣地梅花內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的相似系數(shù)

2.3 聚類分析

以梅花8種組織內(nèi)生真菌種類組成、豐度、定殖率為參數(shù)進行聚類分析，結(jié)果，老枝和新枝皮部聚為一大類，其余組織聚為一大類。葉器官各組織中，葉尖與葉中聚為一小類，葉基與葉柄聚為一小類(圖1)。此現(xiàn)象也說明了不同組織對梅花內(nèi)生真菌的定殖與分布有顯著影響。以相同的參數(shù)對不同樣地內(nèi)生真菌進行聚類分析，結(jié)果，樣地SY3與SH聚為一類，其他樣地聚為一類(圖2)。與相似性分析結(jié)果接近。說明梅花外部環(huán)境對內(nèi)生真菌同樣有重要影響。

L1.老枝皮部；L2.老枝木質(zhì)部；X1.嫩枝皮部；X2.嫩枝木質(zhì)部，Y1.葉柄，Y2.葉基，Y3.葉中，Y4.葉尖。

圖1 梅花8種組織內(nèi)生真菌組成聚類分析

圖2 不同樣地梅花內(nèi)生真菌組成聚類分析

3 結(jié)論與討論

梅花內(nèi)生真菌大多數(shù)為半知菌，少數(shù)為接合菌，其種類豐富，分布普遍，有些真菌分布具組織專一性；曲霉1(Aspergillussp.1)和青霉1(Penicilliumsp.1)是梅花內(nèi)生真菌優(yōu)勢真菌，此二種菌存在于各樣地各種組織內(nèi)，且分離率高；梅花內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與分布與宿主內(nèi)部組織類型和外部生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。

據(jù)研究，大莖點霉(Macrophomasp.)、擬莖點霉(Phomopsissp.)、刺盤孢菌(Colletotrichumsp.)等，在多種植物內(nèi)生真菌群落中均有出現(xiàn)，且分離率較高[11-13]，這些真菌也是梅花內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)中的重要組分，說明他們具有較強的生態(tài)適應性；有關(guān)梅花樹棲真菌研究，僅見呂銳玲等[4]、王英祥等[5]、王爽等[6]對梅花病原真菌進行研究的報道。研究發(fā)現(xiàn)，梅花病原真菌常見有梅葉斑病菌(Ascochytapruni)、梅穿孔病菌(Cercosporacircumscissa)、梅黑斑病菌(Cladosporiumcarpophilum)、梅炭疽病菌(Colletotrichummume)、梅白粉病菌(Oidiumleucoconium)、梅褐斑病菌(Phyllostictamume)、梅膏藥病菌(Septobasidiumbogoriense)、梅葉腫病菌(Taphrinamume)、梅枝枯病菌(Valsaleucostoma)、梅霉污病菌(Fumagovagans)等。這些病菌對梅花的生長發(fā)育危害嚴重。前人研究發(fā)現(xiàn)，有些植物內(nèi)生真菌與病原菌有拮抗關(guān)系，在植物病害防治中具有重要作用[9-10]。梅花內(nèi)生真菌是否對病原菌有抑制作用，它們與上述病原菌生態(tài)關(guān)系如何，尚待深入調(diào)查研究。

[1] 陳俊愉.中國梅花品種分類最新修正體系[J].北京林業(yè)大學學報,1999,21(2):1-6.

[2] 康素紅,包滿珠,陳龍清,等.梅花品種分類的花粉形態(tài)研究[J].園藝學報,1997,24(2):170-174.

[3] 劉德良,賴萬年.夏季梅花品種耐熱性生理生化指標研究[J].北方園藝,2012(2):57-61.

[4] 呂銳玲,付艷蘋,謝甲濤,等.武漢梅花炭疽病病菌的多樣性研究[J].植物科學學報,2011,29(3):377-384.

[5] 王英祥,浦衛(wèi)瓊.云南梅花病害鑒定研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,2000,15(3):256-259.

[6] 王爽,李潔,王建偉,等.北京地區(qū)梅花病害名錄及防控措施[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學,2015(9):172-174.

[7] 袁蒲英,宋興榮.梅花栽培繁殖技術(shù)[J].四川農(nóng)業(yè)科技,2010(8):37.

[8] KUSARI S, ZIJHLKE S, SPITELLER M. An endophytic fungus fromCamptothecaacuminatathat produces camptothecen and analogues[J]. Journal of Natural products,2009,72(1):2-7.

[9] WANG L W, XU B G, WANG J Y, at al. Bioactive metabolites fromPhomaspecies, an endophytic fungus from the Chinese medicinal plantArisaemaerubescens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93(3):1231-1239.

[10] 丁常宏,都曉偉,徐瑩.藥用植物內(nèi)生真菌的功能研究進展[J].中醫(yī)藥學報,2013,41(3):168-171.

[11] 盧東升,盧帥,潘中超,等.水杉內(nèi)生真菌生物多樣性與生態(tài)分布[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版)，2013,37(6):33-36.

[12] 盧東升,王明好,代兵.桂花樹葉棲內(nèi)生真菌種類與分布[J].信陽師范學院學報,2010,24(4):483-486.

[13] 盧東升,張偉,杜醒醒.信陽杉木內(nèi)生真菌種類研究[J].信陽師范學院學報,2015,28(2):199-203，307.

[14] 齊祖同.中國真菌志：第5卷：曲霉屬及其相關(guān)有性型[M].北京:科學出版社,1997.

[15] 孔華忠.中國真菌志：第35卷：青霉屬及其相關(guān)有性型[M].北京:科學出版社,2007.

[16] 魏景超.中國鑒定手冊[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1979.

[17] 戴芳瀾.真菌的形態(tài)與分類[M].北京:科學出版社,1987.

[18] 邵力平,沈瑞祥,張素軒.真菌分類學[M].北京:中國林業(yè)出版社,1984.

[19] 孫劍秋,郭良棟,臧威.藥用植物內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布[J].中國科學(C輯：生命科學),2008,38(5):475-484.

Endophytic Fungi and Their Diversity inPronusmume//

Lu Dongsheng, Hou Zhijie, Wang Tingmin

(Xinyang Normal University, Xinyang 464000, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(1)：86-89.

Pronusmume; Endophytic fungi; Diversity

1)大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用學科群開放課題資助項目(201605)。

盧東升，男， 1962年11月生，信陽師范學院生命科學學院，教授。E-mail:luds0365@sina.com。

2016年8月17日。

S685.17;Q938.1

責任編輯：任 俐。