梁嘉麗， 鄺兆民， 楊 靜， 秦佳佳

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632)

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補(bǔ)腎陰及補(bǔ)腎陽法對化療誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平及卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響*

梁嘉麗， 鄺兆民， 楊 靜， 秦佳佳△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察化療誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠接受補(bǔ)腎陰法和補(bǔ)腎陽法干預(yù)后，其外周血腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)水平及卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況。方法: 48只雌性SD大鼠隨機(jī)分成對照(control)組、環(huán)磷酰胺(CTX)組、環(huán)磷酰胺+補(bǔ)腎陰(CTX+kidney yin)組、環(huán)磷酰胺+補(bǔ)腎陽(CTX+kidney yang)組。ELISA法檢測各組大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平；末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測卵巢顆粒細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測卵巢Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果: CTX組大鼠外周血TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平上升，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡明顯，卵巢中Bax蛋白明顯增多，而Bcl-2蛋白明顯減少。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)腎方藥治療后，外周血TNF-α、IFN-γ水平下降，顆粒細(xì)胞凋亡程度減輕，Bax蛋白減少，Bcl-2蛋白增多，部分指標(biāo)變化以CTX+kidney yin組較為明顯。結(jié)論: 補(bǔ)腎陰及補(bǔ)腎陽法可通過調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bax、Bcl-2蛋白及外周血TNF-α、IFN-γ的水平，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，恢復(fù)卵巢功能、增強(qiáng)儲(chǔ)備能力。

卵巢早衰； 補(bǔ)腎陰法； 補(bǔ)腎陽法； 化療

化療所致的卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)在臨床上多表現(xiàn)為青年婦女的閉經(jīng)、不孕及煩熱盜汗、腰膝酸軟等圍絕經(jīng)期癥狀體征，病理上表現(xiàn)為卵巢的萎縮、皮質(zhì)纖維化、無始基卵泡等等。目前西醫(yī)治療既有療效亦存隱憂。中醫(yī)認(rèn)為，腎主生殖，認(rèn)識(shí)本病病機(jī)以腎虛為主，治療以補(bǔ)腎為首。適當(dāng)?shù)闹嗅t(yī)藥治療有“簡便廉驗(yàn)”的優(yōu)勢。本課題組前期研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎方藥能使各級(jí)卵泡及黃體數(shù)增加，提高體內(nèi)雌二醇(estradial, E2)水平，降低外周血促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)水平，抑制抗卵巢抗體(anti-ovarian antibody, AoAb)產(chǎn)生，尤以補(bǔ)腎陰組作用顯著[1]。在此基礎(chǔ)上，本文繼續(xù)研究化療后補(bǔ)腎陰、補(bǔ)腎陽法對卵巢早衰大鼠的相關(guān)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)表達(dá)、卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，以探索更切合化療后卵巢早衰病機(jī)的補(bǔ)腎方法。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和主要試劑

SPF級(jí)雌性Sprague Dawley(SD)大鼠48只，3月齡，體重(220±15) g，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，粵監(jiān)證字2008A002。

金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司)每20丸相當(dāng)于4 g原生藥。六味地黃丸(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司)每8丸相當(dāng)于3 g原生藥。用藥劑量按人與大鼠體表面積折算的等效劑量比值0.018計(jì)算[2]。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。TNF-α、IFN-γ酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(Rapid Bio)；末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling, TUNEL)試劑盒(南京凱基公司)；Super EC Plus發(fā)光試劑盒(Thermo)；BCA蛋白定量試劑盒(博彩生物公司)。

2 主要方法

2.1 造模及給藥 48只SPF級(jí)雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)等分為：對照(control)組；CTX組；環(huán)磷酰胺+補(bǔ)腎陰(CTX+kidney yin)組；環(huán)磷酰胺+補(bǔ)腎陽(CTX+kidney yang)組。給藥方法：第1～15天，control組大鼠腹腔注射生理鹽水，每天1次，每次每只動(dòng)物2 mL，連續(xù)15 d；其余3組大鼠首日按50 mg/kg劑量、第2～15天按8 mg/kg劑量腹腔注射CTX造模[3]。第16天開始，control、CTX組大鼠用生理鹽水灌胃，每天1次，每次每只動(dòng)物2 mL；CTX+kidney yin組大鼠用六味地黃丸按0.945 g/kg劑量溶于2 mL生理鹽水后灌胃；CTX+kidney yang組大鼠用金匱腎氣丸按1.260 g/kg劑量溶于2 mL生理鹽水后灌胃，每天1次，連續(xù)28 d。

2.2 ELISA法檢測大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平 對大鼠行腹主動(dòng)脈取血，離心取血清后于-80℃超低溫保存待檢。檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，簡要步驟：稀釋標(biāo)本及洗滌液→設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品→加樣孵育→加第I抗體孵育→加酶標(biāo)工作液孵育→加底物工作液孵育→終止并測吸光度(A)值。

2.3 TUNEL法檢測顆粒細(xì)胞凋亡 嚴(yán)格按照凱基公司試劑說明書操作，簡要步驟：石蠟樣品脫蠟及水化，用蛋白酶K修復(fù)，封閉；滴加TdT酶工作液反應(yīng)，滴加HRP工作液反應(yīng)，使用DAB顯色，蘇木復(fù)染，顯微鏡觀察拍照。鏡下細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性細(xì)胞。顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

2.4 Western blot法檢測各組大鼠卵巢內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 簡要步驟：裂解卵巢組織，提取上清總蛋白；BCA法測量蛋白濃度；加入蛋白上樣緩沖液電泳至溴酚蘭線接近膠底；低溫轉(zhuǎn)膜后室溫封閉；加Ⅰ抗、Ⅱ抗工作液進(jìn)行免疫反應(yīng)；化學(xué)發(fā)光；暗室壓片，保存分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0處理。檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。計(jì)量資料采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齊性，用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；若方差不齊，采用Tamhane’s T2法進(jìn)行組間比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平

與control組比較，CTX造模后大鼠外周血中TNF-α、IFN-γ的表達(dá)明顯上升(P<0.01)；經(jīng)補(bǔ)腎藥物治療后，TNF-α、IFN-γ表達(dá)均有所下降(P<0.05)，其中CTX+kidney yin組IFN-γ水平低于CTX+kidney yang組(P<0.01),見表1。

2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況

Control組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡較少(P<0.01)，且凋亡細(xì)胞染色較淺；CTX組大鼠可見較多閉鎖卵泡，凋亡細(xì)胞主要圍繞閉鎖卵泡，均勻散布于顆粒細(xì)胞中，且凋亡染色較深，卵泡腔內(nèi)亦見染色；CTX+kidney yin組大鼠凋亡染色多存在顆粒細(xì)胞內(nèi)層及卵泡液中，凋亡細(xì)胞較CTX組明顯減少(P<0.01)，染色亦淺；CTX+kidney yang組大鼠可見較多的凋亡細(xì)胞，其凋亡細(xì)胞散在顆粒細(xì)胞各層，但在內(nèi)層靠近卵泡液處染色較深，其凋亡數(shù)目及染色強(qiáng)度較CTX組弱(P<0.05)，但明顯強(qiáng)于CTX+kidney yin組(P<0.01)，見圖1、表2。

3 Western blot法檢測大鼠卵巢中Bax、Bcl-2蛋白含量

CTX組卵巢中Bax蛋白表達(dá)較control組明顯增多，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)。經(jīng)補(bǔ)腎藥物治療后，Bax蛋白表達(dá)減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)增多(P<0.01)，CTX+kidney yin組與CTX+kidney yang組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平

Table 1. The levels of TNF-α and IFN-γ in serum of rats in different groups (ng/L. Mean ± SD)

GroupnTNF?αIFN?γControl100．16±0．250．38±0．08CTX111．09±0．48△△0．74±0．11△△CTX+kidneyyin120．83±0．10??0．47±0．07??CTX+kidneyyang110．90±0．09??0．64±0．10?##

△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsCTX group;##P<0.01vsCTX+kidney yin group.

Figure 1. Apoptosis of ovarian granulosa cells in rats (TUNEL,×100).

圖1 TUNEL法檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡

表2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)

Table 2. Apoptotic index of ovarian granulosa cells in rats (%. Mean±SD)

GroupnApoptoticindexControl1036±12CTX11 78±21△△CTX+kidneyyin1249±14??CTX+kidneyyang11 64±14??##

△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsCTX group;##P<0.01vsCTX+kidney yin group.

討 論

西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為，卵巢受下丘腦-垂體-卵巢生殖軸調(diào)控；中醫(yī)認(rèn)為，腎主生殖，卵巢是“腎-天癸-沖任-胞宮”生殖軸功能實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵一環(huán)。卵巢儲(chǔ)備的始基卵泡數(shù)目有限，而化療容易損害顆粒細(xì)胞，可能使各級(jí)生長卵泡凋亡、始基卵泡過度激活、血管損傷及纖維化等[4]導(dǎo)致生殖軸的功能損害，使卵巢難以正常分泌性激素，排卵異常，加速儲(chǔ)備耗竭而早衰。卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能密切相關(guān)[5]，細(xì)胞異常凋亡致卵泡閉鎖是本疾病發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)因素，由多種因子介導(dǎo)調(diào)控。

卵巢早衰大鼠中，TNF-α和IFN-γ在卵巢組織的蛋白及基因表達(dá)增多[6-7]，IFN-γ可誘發(fā)增強(qiáng)顆粒細(xì)胞上MHC抗原的表達(dá)，激活I(lǐng)L-1、IL-2、TGF-β、TNF-α、FGF等一系列細(xì)胞因子產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)使卵泡閉鎖[8]。TNF-α可致血管內(nèi)皮損傷[9]，影響卵巢局部血運(yùn)，使激素分泌及各級(jí)卵泡生長發(fā)育受阻；TNF-α能夠通過神經(jīng)鞘氨醇和ICE/CED3連接半胱氨酸蛋白酶通路[10]，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞及早期卵泡的凋亡[11]。

調(diào)控細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族蛋白中，抑制因子Bcl-2和促進(jìn)因子Bax優(yōu)勢表達(dá)于生長卵泡的顆粒細(xì)胞，作用于卵巢生長發(fā)育的全過程，Bcl-2在發(fā)育中的黃體表達(dá)更強(qiáng)，Bax在退化的黃體中表達(dá)更強(qiáng)，二者對立地調(diào)控著卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡水平[12]。當(dāng)小鼠Bcl-2基因缺失，卵泡數(shù)量會(huì)減少[13]；Bcl-2轉(zhuǎn)基因鼠則抑制卵泡閉鎖，減少自發(fā)性的或由藥物誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞凋亡[14]。

本實(shí)驗(yàn)中，化療誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠外周血中TNF-ɑ、IFN-γ表達(dá)水平升高，卵巢中Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增多，卵泡閉鎖多而凋亡染色深；補(bǔ)腎藥物干預(yù)后，TNF-ɑ、IFN-γ表達(dá)水平下降， Bcl-2蛋白表達(dá)增多、Bax蛋白表達(dá)減少，顆粒細(xì)胞凋亡受到抑制。結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，補(bǔ)腎方藥可上調(diào)E2、下調(diào)FSH水平，增加各級(jí)卵泡和黃體數(shù)，說明補(bǔ)腎藥物可通過調(diào)節(jié)TNF-ɑ、IFN-γ等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax系統(tǒng)平衡，來延緩卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，延緩各級(jí)卵泡閉鎖，改善生殖軸的功能、增強(qiáng)卵巢儲(chǔ)備能力。

Figure 2. The expression of Bcl-2 and Bax proteins detected by Western blot. Mean±SD.n=10～12.△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsCTX group.

圖2 Western blot法檢測卵巢中Bcl-2、Bax蛋白含量

部分指標(biāo)結(jié)果中補(bǔ)腎之陰優(yōu)于補(bǔ)腎之陽，與中醫(yī)臨癥腎虛為主、陰虛更著的表現(xiàn)相符。故治療上以補(bǔ)腎為主，調(diào)陰為佳。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effects of tonifying kidney yin and yang on expressions of TNF-α, IFN-γ in peripheral blood and apoptosis of granulosa cells in chemotherapy-induced premature ovarian failure rats

LIANG Jia-li, KUONG Sio-man, YANG Jing, QIN Jia-jia

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:jiajia_bamboo@163.com)

AIM: To treat the chemotherapy-induced premature ovarian failure (POF) rats with the methods of tonifying kidney yin and yang by observing the indicator changes in apoptosis of ovarian granulosa cells and related cytokines before and after medication. METHODS: SD rats (n=36) were chronically given intraperitoneal injection of cyclophosphamide (CTX) for 15 d in order to establish the animal model of POF. The rats were randomly divided into control group, CTX group, CTX+kidney yin group and CTX+kidney yang group. The levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interferon gamma (IFN-γ) in the peripheral blood were detected by ELISA. The apoptosis of ovarian granulosa cells was observed by TUNEL method. The levels of apoptosis related proteins were determined by Western blot. RESULTS: After modeling, the levels of TNF-α and IFN-γ in the peripheral blood were significantly increased. The protein expression of Bax was up-regulated and Bcl-2 was down-regulated. The apoptosis of ovarian granulosa cells was significantly induced with a deep staining. After treatment with tonifying kidney yin and yang, the levels of TNF-α and IFN-γ in the peripheral blood were decreased, the protein expression of Bax was down-regulated and Bcl-2 was up-regulated, and the apoptosis of ovarian granulosa cells was reduced. CONCLUSION: The reserve function of the ovarian can be recovered by prescriptions of tonifying the kidney yin and yang via regulating the expression of TNF-α, IFN-γ, Bax and Bcl-2, and inhibiting the apoptosis of ovarian granulosa cells.

Premature ovarian failure; Method of tonifying the kidney yin; Method of tonifying the kidney yang; Chemotherapy

1000- 4718(2017)01- 0139- 04

2016- 05- 23

2016- 10- 28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81373805)；廣東省社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃(No. 2013B021600001)

R363; R271.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.023

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