肖韓艷， 張本卓， 韓麗萍， 徐 鳳

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科， 2兒科， 3老年病科，黑龍江 牡丹江 157011)

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血管緊張素Ⅱ 2型受體拮抗劑EMA401對(duì)神經(jīng)性疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制研究*

肖韓艷1， 張本卓1， 韓麗萍2， 徐 鳳3△

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2兒科，3老年病科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的： 觀察血管緊張素Ⅱ 2型受體拮抗劑EMA401對(duì)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)表達(dá)的影響。方法: 采用SD大鼠建立CCI模型，隨機(jī)分為4組：模型組(model組)，給予等體積生理鹽水灌胃；低劑量組，按照EMA401 5 mg/kg劑量灌胃；中劑量組，按照EMA401 10 mg/kg劑量灌胃；高劑量組，按照EMA401 20 mg/kg劑量灌胃。另設(shè)假手術(shù)組，給予等體積生理鹽水灌胃。各組于術(shù)前、術(shù)后7 d、14 d和28 d同一時(shí)間測(cè)定熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)和機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)行為學(xué)指標(biāo)。行為學(xué)檢測(cè)完畢后，各組大鼠取腰段DRG，采用鄰甲酚酞絡(luò)合銅微板法檢測(cè)DRG內(nèi)Ca2+濃度，采用Western blotting和RT-PCR分析檢測(cè)DRG內(nèi)GAP-43、PKC和CaM蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果: 與model組比較，EMA401顯著升高CCI大鼠TWL和MWT(P<0.05)；與model組比較，EMA401顯著降低DRG內(nèi)Ca2+濃度及GAP-43、PKC、CaM蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。結(jié)論: EMA401對(duì)CCI大鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制DRG內(nèi)Ca2+濃度及GAP-43、PKC、CaM表達(dá)有關(guān)。

EMA401； 神經(jīng)性疼痛； 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43； 蛋白激酶C； 鈣調(diào)素

神經(jīng)性疼痛(neuropathic pain)是由于多種誘因引起的外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)最初的損傷或功能紊亂而導(dǎo)致的慢性疼痛，患病率為1%～8%，臨床上可表現(xiàn)為燒灼痛和痛覺(jué)異常、自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏等，其患病率高，病因復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。近年來(lái)，神經(jīng)性疼痛機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō)，其中以中樞敏化學(xué)說(shuō)研究較多，但是具體機(jī)制仍然不清。中樞敏化是產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛敏感的重要原因，具有存在上揚(yáng)現(xiàn)象和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long-term potentiation，LTP)的特點(diǎn)。

已知血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)參與了神經(jīng)性疼痛的機(jī)制。EMA401是一種新型小分子高選擇性血管緊張素II 2型受體(angiotensin II type 2 receptor，AT2R)拮抗劑，對(duì)神經(jīng)性疼痛具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[3]。據(jù)報(bào)道，EMA401可通過(guò)抑制脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)內(nèi)Ang II/神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)/瞬時(shí)受體電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1)信號(hào)通路而對(duì)神經(jīng)性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[4]。但是，關(guān)于EMA401與神經(jīng)性疼痛中樞敏化的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。故此，本研究通過(guò)建立坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)模型，觀察EMA401對(duì)神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并且進(jìn)一步觀察其對(duì)DRG內(nèi)Ca2+濃度及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)表達(dá)的影響，探討EMA401對(duì)神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重(200±20)g，自由攝食飲水，光照周期12 h/12 h，室溫(20±2)℃，濕度40%～60%飼養(yǎng)。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為P00102008。

1.2 藥物和試劑 EMA401(Spinifex)純度>99.0%，以生理鹽水配制成2 g/L溶液，4 ℃儲(chǔ)存，備用；Ca2+檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；小鼠抗大鼠GAP-43抗體、CaM多克隆抗體、PKC多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgGⅡ抗(Santa Cruz)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中杉金橋公司)；二喹啉酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)；RT-qPCR試劑盒(上海生物科技公司)。

1.3 主要儀器 Vonfrey 測(cè)痛套件(DanMic Glo-bal)；熱輻射測(cè)痛儀(IITC Life Science)；紫外分光光度計(jì)(普析通用公司)；PCR儀(Thermofisher Scientific)；電泳儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 CCI模型制備及分組 SD大鼠60只，分別沿大鼠脊柱L5～L6節(jié)段處做一約3 cm縱向正中皮膚切口，將肌肉做鈍性分離，暴露出椎骨，去除棘突和椎板。將20 mL注射器針頭緩慢穿入L5/L6椎間隙，以大鼠出現(xiàn)一過(guò)性甩尾或后肢抽動(dòng)作為針頭穿過(guò)硬脊膜的標(biāo)準(zhǔn)。PE-10導(dǎo)管(注滿生理鹽水)通過(guò)針頭送入蛛網(wǎng)膜下腔至L5～L6節(jié)段脊髓腰段處，固定導(dǎo)管，依次將肌肉和皮膚進(jìn)行縫合。置管3 d后，選取無(wú)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙的大鼠鞘內(nèi)注射2% 利多卡因20μL。如注藥30 s后，未出現(xiàn)雙下肢麻痹，舍去；如注藥30 s后，出現(xiàn)雙下肢麻痹表示置管成功。共成功45只，正常飼養(yǎng)5 d，用于實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將置管成功的45只大鼠隨機(jī)分為5組(n=9)：假手術(shù)組(sham組)，消毒后麻醉，只暴露坐骨神經(jīng)，但不結(jié)扎，灌胃給予等劑量生理鹽水， 每天2次，共28 d；CCI模型組(model組)，消毒后麻醉，暴露坐骨神經(jīng)并結(jié)扎，結(jié)扎強(qiáng)度以不完全阻斷血管為宜，灌胃給予等劑量生理鹽水， 每天2次，共28 d；EMA401治療組，消毒后麻醉，暴露坐骨神經(jīng)并結(jié)扎，結(jié)扎強(qiáng)度以不完全阻斷血管為宜，分為低劑量(low dose, LD)組、中劑量(medium dose, MD)組、高劑量(high dose, HD)組，分別按照5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg灌胃給予EMA401， 每天2次，共28 d[5]。

2.2 疼痛行為學(xué)檢測(cè)

2.2.1 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)的測(cè)定 各組大鼠于術(shù)前24 h測(cè)定TWL作為基礎(chǔ)痛閾，術(shù)后7 d、14 d和28 d再分別測(cè)定TWL。測(cè)定時(shí)間固定于上午8∶00～12∶00，室溫維持在(25.0±0.5)℃。使用ⅡTC熱輻射測(cè)痛儀測(cè)定TWL。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：用熱輻射測(cè)痛儀照射模型大鼠跖部，從照射開始直到大鼠出現(xiàn)縮腿回避反射的時(shí)間作為TWL。將大鼠放置在透明有機(jī)玻璃檢測(cè)箱中(20 cm×20 cm×20 cm)，檢測(cè)箱的底部為2 mm的普通玻璃板，待模型大鼠安靜30 min以適應(yīng)檢測(cè)箱環(huán)境。測(cè)定開始時(shí)，將輻射燈頭從檢測(cè)箱底部的玻璃板以一定的距離照射大鼠一側(cè)后肢跖部中后1/3處，當(dāng)大鼠該側(cè)出現(xiàn)縮腿回避反射時(shí)，記錄時(shí)間，即為TWL。熱輻射強(qiáng)度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持一致，如TWL超過(guò)30 s，測(cè)痛儀自動(dòng)關(guān)閉，防止灼傷大鼠，TWL記錄為30 s。每只大鼠測(cè)定3次，每次間隔時(shí)間30 min，取其平均值。

2.2.2 機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal thres-hold，MWT)的測(cè)定 各組大鼠于術(shù)前24 h測(cè)定MWT作為基礎(chǔ)痛閾，術(shù)后7 d、14 d、28 d再分別測(cè)定MWT。測(cè)定時(shí)間固定于上午8：00～12：00，室溫維持在(25±0.5)℃。使用Vonfrey 測(cè)痛套件測(cè)定MWT。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，Vonfrey纖維絲彎曲90°無(wú)抬足反應(yīng)為陰性。將大鼠放置在透明有機(jī)玻璃檢測(cè)箱中(22 cm×12 cm×22 cm)，檢測(cè)箱的底部為金屬篩網(wǎng)，待模型大鼠安靜30 min以適應(yīng)檢測(cè)箱環(huán)境。用von Frey 纖維絲(壓力值依次為0.41、0.52、0.87、1.16、2.05、3.61、5.50、8.28、10.33和15 g)垂直刺激大鼠一側(cè)后肢跖部中部，持續(xù)時(shí)間不要超過(guò)30 s，初始刺激壓力值2.05 g，如果出現(xiàn)陰性反應(yīng)，則選擇高一級(jí)壓力值；如果出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則選擇低一級(jí)壓力值，依此類推，直至出現(xiàn)第一次陽(yáng)性和陰性反應(yīng)的壓力值(最大壓力值為15 g，大于15 g時(shí)，記錄為15 g)，再連續(xù)測(cè)定3次，每次間隔時(shí)間30 min。計(jì)算每只大鼠的50 %機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(內(nèi)推法)作為MWT，50 %機(jī)械縮足閾值=10logX+κδ(X代表最后一次刺激壓力值；κ代表不同刺激方式的系數(shù)，到內(nèi)推法的表格中查找對(duì)應(yīng)的值；δ=0.179，代表刺激壓力值取對(duì)數(shù)后間距的平均值)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè) 疼痛行為學(xué)檢測(cè)完畢后，每組取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，行左心室-主動(dòng)脈插管，經(jīng)管依次37 ℃生理鹽水200 mL快速?zèng)_洗， 37 ℃ PBS(含4%多聚甲醛)350 mL灌流。迅速取出左側(cè)L5～L6背根神經(jīng)節(jié)，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，冰上研磨，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清。按照Ca2+檢測(cè)試劑盒[鄰甲酚酞絡(luò)合銅(o-cresolphthalein complexone，OCPC)微板法]說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。配置Ca2+及考馬斯亮藍(lán)G250蛋白標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)工作液，分光光度計(jì)于575 nm處檢測(cè)各組吸光度(A)，以空白調(diào)零。Ca2+濃度(mol/g)=A測(cè)定/A標(biāo)準(zhǔn)×2.5/考馬斯亮藍(lán)G250蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)。每份樣品檢測(cè)3次。

2.4 Western blotting分析蛋白表達(dá) 疼痛行為學(xué)檢測(cè)完畢后，每組取大鼠3只，取L5～L6DRG。BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣后進(jìn)行10% SDS-PAGE。當(dāng)電泳完成后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉PBST(含25 mol/L、150 mol/L NaCl和0.1% Tween 20)4 ℃封閉2 h。然后加入小鼠抗大鼠GAP-43抗體、CaM多克隆抗體和PKC多克隆抗體(1∶1 000稀釋；對(duì)照組以PBS代替Ⅰ抗)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌后，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔第Ⅱ抗體(1∶2 000稀釋；對(duì)照組以PBS代替第Ⅱ抗體)室溫孵育2 h。PBST洗滌 5 min、3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行灰度值及統(tǒng)計(jì)分析。GAPDH抗體孵育方法與上述方法相同，蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。每份樣品檢測(cè)3次。

2.5 RT-PCR分析mRNA表達(dá) 疼痛行為學(xué)檢測(cè)完畢后，每組取大鼠3只，取L5～L6DRG。TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。利用Pubmed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。GAP-43的上游引物序列為5’-TGCCTGCTGCTGTCACTGA-3’，下游引物序列為5’-GGCAGGAGAGACAGGGTTCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為254 bp；PKC的上游引物序列為5’-CCGCCTCTACTTTGTGAT-3’，下游引物序列為5’-CCTTGCGTTCGAGTTTCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為592 bp；CaM的上游引物序列為5’-TGGCTACCCACCCTTTTATG-3’，下游引物序列為5’-CTTGATCTGCTCGCTCACTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為115 bp；GAPDH的上游引物序列為5’-TACAACCTTCTTGCAGCTCC-3’，下游引物序列為5’-ACAATGCCGTGTTCAATGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為245 bp。反應(yīng)體系為RT-PCR酶混合物2.0 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s，共32個(gè)循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色。Gel Doc 1000成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描和條帶灰度值分析。相對(duì)mRNA表達(dá)水平=目的基因條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每份樣品檢測(cè)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。首先對(duì)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性進(jìn)行檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，繼之多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較，采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 疼痛行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠術(shù)前的TWL和MWT之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Model組大鼠術(shù)后全部出現(xiàn)了舔舐、懸空、足呈輕度外翻狀、跛行等疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，TWL和MWT均顯著降低，與術(shù)前和sham組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LD組、MD組和HD組7 d、14 d和28 d 的TWL和MWT均顯著升高，與model組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各時(shí)點(diǎn)每組大鼠TWL和MWT的變化

*P<0.05,**P<0.01vsbefore surgery;#P<0.05,##P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2 DRG內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè)結(jié)果

Model組大鼠DRG內(nèi)的Ca2+濃度顯著升高，與sham組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。LD組、MD組和HD組DRG內(nèi)的Ca2+濃度顯著降低，與model組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

3 Western blotting分析結(jié)果

Model組大鼠DRG內(nèi)的GAP-43、PKC 和 CaM均呈高表達(dá)，與sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。LD、MD和HD組DRG內(nèi)的GAP-43、PKC和CaM表達(dá)量均顯著降低，與model組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The Ca2+concentration detected by OCPC microplating method. Mean±SD.n=9.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖1 EMA401對(duì)Ca2+濃度的影響

Figure 2.The protein levels of GAP-43, PKC and CaM detected by Western blotting. Mean±SD.n=9.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖2 EMA401對(duì)GAP-43、PKC和CaM蛋白表達(dá)的影響

4 RT-PCR分析結(jié)果

Model組大鼠DRG內(nèi)GAP-43、PKC 和 CaM的mRNA均呈高表達(dá)，與sham組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。LD、MD和HD組DRG內(nèi)GAP-43、PKC和CaM的mRNA表達(dá)量均顯著降低，與model組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The mRNA expression of GAP-43, PKC and CaM detected by RT-PCR. Mean±SD.n=9.**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖3 EMA401對(duì)GAP-43、PKC和CaM mRNA表達(dá)的影響

討 論

EMA401是一種通過(guò)阻斷Ang II而治療神經(jīng)疼痛的藥物，目前已經(jīng)進(jìn)入II期臨床研究階段，可使58%的實(shí)驗(yàn)組患者平均疼痛強(qiáng)度較前下降30%，而且具有很好的安全性，最大耐受量(maximum tolerated dose，MTD)可達(dá)400 mg。本研究中，model組TWL和MWT均顯著升高，說(shuō)明神經(jīng)性疼痛模型制備成功。參照文獻(xiàn)[3]并根據(jù)臨床給藥途徑和給藥時(shí)間，按照體表面積折算后，按照10 mg/kg給予EMA401灌胃給藥，并增設(shè)5 mg/kg和20 mg/kg 2組，結(jié)果表明，EMA401可使CCI大鼠TWL和MWT顯著延長(zhǎng)。以上結(jié)果說(shuō)明，EMA401確實(shí)對(duì)神經(jīng)性疼痛具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，可以抑制痛覺(jué)過(guò)敏，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

研究證實(shí)，神經(jīng)性疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)可塑性功能的主要表現(xiàn)模式——LTP密切相關(guān)[6]。LTP與神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、損傷和再生有關(guān)的GAP-43常常作為神經(jīng)可塑性的分子標(biāo)志。GAP-43是神經(jīng)發(fā)育和再生過(guò)程中與軸突生長(zhǎng)有關(guān)的內(nèi)在決定因子和標(biāo)志性蛋白，參與軸突和突觸形成，在生長(zhǎng)的神經(jīng)中GAP-43表達(dá)增多，可作為神經(jīng)生長(zhǎng)的標(biāo)志[7-9]。有研究表明，GAP-43是參與形成神經(jīng)性疼痛過(guò)敏的基礎(chǔ)之一，GAP-43的表達(dá)增加，引起痛覺(jué)過(guò)敏和超敏，參與和維持LTP[10]。另外，GAP-43除了參與細(xì)胞排粒作用、靶細(xì)胞識(shí)別、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、軸突生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)運(yùn)以及突觸建立、再生和功能調(diào)節(jié)外，其磷酸化狀態(tài)與LTP的建立和維持關(guān)系密切，進(jìn)而對(duì)突觸的可塑性產(chǎn)生影響[11]。GAP-43含有一個(gè)與CaM結(jié)合域同源的“IQ”序列，從而使其具備調(diào)節(jié)Ca2+流量和CaM的能力，GAP-43與CaM的動(dòng)力學(xué)結(jié)合/離解過(guò)程在神經(jīng)生長(zhǎng)、出芽、再生、突觸形成過(guò)程中扮演重要角色[12]。當(dāng)傷害性刺激傳入末梢所釋放的興奮性氨基酸(如谷氨酸)興奮DRG，突觸后膜內(nèi)游離Ca2+增多，激活鈣蛋白酶、磷脂酶C等多種鈣依賴酶，隨后鈣貯存庫(kù)釋放細(xì)胞內(nèi)Ca2+，Ca2+濃度進(jìn)一步升高，GAP-43/CaM解離，激活PKC對(duì)GAP-43的磷酸化，誘發(fā)LTP。

本研究發(fā)現(xiàn)，EMA401可使DRG內(nèi)Ca2+濃度降低，GAP-43、PKC和CaM表達(dá)均降低，其機(jī)制可能是EMA401阻斷AT2R，減少Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致DGR內(nèi)GAP-43/CaM不易解離，從而抑制PKC活性，進(jìn)而使GAP-43釋放水平降低，LTP得到抑制，最終緩解神經(jīng)性疼痛。

綜上所述，EMA401對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其機(jī)制可能與其降低DRG內(nèi)Ca2+濃度，從而降低GAP-43、PKC和CaM的表達(dá)有關(guān)。

[1] 葉永賢，林 洪，沙 漠，等. 神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NF-κB、NR2B和iNOS的表達(dá)及意義[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2014，30(4):598-602.

[2] Nascimento OJ, Pessoa BL, Orsini M, et al. Neuropathic pain treatment: still a challenge[J]. Neurol Int, 2016, 8(2):6322.

[3] Smith MT, Wyse BD, Edwards SR. Small molecule angiotensin II type 2 receptor (AT2R) antagonists as novel analgesics for neuropathic pain: comparative pharmaco-kinetics， radioligand binding, and efficacy in rats[J]. Pain Med, 2013, 14(5):692-705.

[4] Anand U, Yiangou Y, Sinisi M, et al. Mechanisms underlying clinical efficacy of angiotensin II type 2 receptor (AT2R) antagonist EMA401 in neuropathic pain: clinical tissue andinvitrostudies[J]. Mol Pain, 2015, 11:38.

[5] Anand U, Facer P, Yiangou Y, et al. Angiotensin II type 2 receptor (AT2R) localization and antagonist-mediated inhibition of capsaicin responses neurite outgrowth in human and rat sensory neurons[J]. Eur J Pain, 2013, 17(7):1012-1026.

[6] Ohnami S, Kato A, Ogawa K, et al. Effects of milnacipran, a 5-HT and noradrenaline reuptake inhibitor, on C-fibre-evoked field potentials in spinal long-term potentiation and neuropathic pain[J]. Br J Pharmacol, 2012, 167(3):537-547.

[7] Grasselli G, Mandolesi G, Strata P, et al. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres followinginvivosilencing of the growth-associated protein GAP-43[J]. PLoS One, 2011, 6(6):e20791.

[8] 姜月華， 馬度芳， 楊金龍， 等. 交感神經(jīng)損毀導(dǎo)致的心肌損傷及桂枝湯的保護(hù)作用[J].中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(4):750-754.

[9] 冷玉芳， 高翊博， 白 潔. 腹腔聯(lián)合注射氯胺酮及可樂(lè)定對(duì)CCI模型大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 17(5):304-308.

[10]Williams S, Mmbaga N, Chirwa S. Dopaminergic D1 receptor agonist SKF 38393 induces GAP-43 expression and long-term potentiation in hippocampusinvivo[J]. Neurosci Lett， 2006, 402(1-2):46-50.

[11]Bekar E, Altunkaynak BZ, BalcK, et al. Effects of high fat diet induced obesity on peripheral nerve regeneration and levels of GAP 43 and TGF-β in rats[J]. Biotech Histochem, 2014, 89(6):446-456.

[12]冷玉芳， 高翊博， 白 潔. 氯胺酮對(duì)CCI大鼠背根神經(jīng)節(jié)GAP-43 mRNA表達(dá)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志, 2010, 26(11):996-998.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Analgesic effect of angiotensin angiotensin Ⅱ type 2 receptor antagonist EMA401 on neuropathic pain in rats and its mechanism

XIAO Han-yan1, ZHANG Ben-zhuo1, HAN Li-ping2, XU Feng3

(1DepartmentofNeurology,2DepartmentofPediatrics,3DepartmentofGeriatrics,theSecondAffiliatedHospitalofMudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China.E-mail:xufeng1976@sina.com)

AIM: To explore whether angiotensin Ⅱ type 2 receptor antagonist EMA401 decreases neuropathic pain and the expression of growth-associated protein-43 (GAP-43), protein kinase C (PKC) and calmodulin (CaM) in dorsal root ganglia (DRG) during chronic constriction injury (CCI) in rats. METHODS: SD rats were used to establish CCI model and randomly divided into 4 groups. The rats in model group were given equal volume of normal saline by intragastric administration. The rats in low dose (LD) group were given 5 mg/kg EMA401 by intragastric administration. The rats in middle dose (MD) group were given 10 mg/kg EMA401 by intragastric administration. The rats high dose (HD) group were given 20 mg/kg EMA401 by intragastric administration. The rats in sham operation group received equal volume of normal saline by intragastric administration. Thermal withdrawal latency (TWL) and mechanical withdrawal threshold (MWT) were measured before operation and 7 d, 14 d and 28 d after CCI. After behavioral test, DRG of lumbar spinal was obtained from each group, and was used to determine Ca2+concentration byo-cresolphthalein complexone microplating method, and the expression of GAP-43, PKC and CaM at mRNA and protein levels by Western blotting and RT-PCR. RESULTS: Compared with model group, EMA401 significantly increased the TWL and MWT (P<0.05). Meanwhile, EMA401 significantly reduced Ca2+concentration and the expression of GAP-43, PKC and CaM at mRNA and protein levels in the DRG (P<0.05). CONCLUSION: EMA401 may attenuate neuropathic pain of CCI by inhibiting Ca2+concentration and the expression of GAP-43, PKC and CaM.

EMA401; Neuropathic pain; Growth-associated protein-43; Protein kinase C; Calmodulin

1000- 4718(2017)01- 0110- 06

2016- 08- 02

2016- 09- 28

黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(No. JS215H647)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.018

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