李 楊，顏新敏，吳國華，李 健，葉奕優(yōu)，趙志荀，朱海霞，張志東，張 強(qiáng)

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046; 2．深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

羊痘的診斷與疫苗研究進(jìn)展

李 楊1，顏新敏1，吳國華1，李 健1，葉奕優(yōu)2，趙志荀1，朱海霞1，張志東1，張 強(qiáng)1

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046; 2．深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

羊痘病毒粒子大小約為150 Kbp，分子量約為73～91 MDa。該病毒能引起羊的急性、熱性、接觸性傳染病，因其病毒結(jié)構(gòu)及其發(fā)病癥狀和人類的天花很像，又稱“羊天花”。根據(jù)分離的毒株不同，羊群的發(fā)病率為75%～100%，死亡率在10%～58%。目前沒有特效治療藥，只有通過實(shí)驗(yàn)室診斷和免疫預(yù)防來減少疾病的發(fā)生。

1 血清學(xué)診斷

瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGPT): 早在1963年Bhalnbani和krish就應(yīng)用同源或異源血清通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對羊痘病進(jìn)行診斷［1］，但是存在羊痘和傳染性膿皰性皮炎(CPD)的抗原交叉反應(yīng)。1986年對常規(guī)的AGPT做了改進(jìn)，采用S35蛋氨酸標(biāo)記抗原，提高了檢測的靈敏度。

對流免疫電泳(CIEP): 1985年建立了對流免疫電泳快速診斷綿羊痘的方法，CIEP在檢測感染組織和細(xì)胞中的特異性抗原比AGPT敏感和快速。1999年Rao等［2］設(shè)計電泳時用巴比妥緩沖液代替普通的鹽溶液極大地提高了CIEP的敏感性。

熒光抗體技術(shù)(FAT): 1986年Soman等通過FAT對感染羊腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞的羊痘病毒抗原進(jìn)行檢測［3］。此方法快速簡單，在抗原感染14～24 h之間就能被檢測到。也能夠檢測到感染動物水皰瘡液、皮膚、LK和LT細(xì)胞中的羊痘病毒抗原。

血凝試驗(yàn)(Hemagglutination Test，HT): 羊痘病毒因?qū)游锛t細(xì)胞不產(chǎn)生凝集作用，用致敏的綿羊紅細(xì)胞來進(jìn)行血凝試驗(yàn)。1989年，Joshi等通過將羊痘抗體連接到葡萄球菌A蛋白(SPA)上，成功的建立了檢測羊痘的協(xié)同凝集試驗(yàn)。2005年，王開功等［4］采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細(xì)胞建立的反向間接血凝試驗(yàn)，對山羊痘病毒抗原具有特異性和敏感性，對疫區(qū)采集的山羊痘待檢抗原的檢測結(jié)果表明，反向間接血凝法的敏感性比瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)高。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA): ELISA是抗原抗體反應(yīng)與酶促反應(yīng)相結(jié)合的一種技術(shù)，因其快速、便利、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)被應(yīng)用于羊痘病的診斷。1988年，Sharma等［5］首次將ELISA用于山羊痘病毒的檢測，通過用活的和滅活的抗原與高免血清檢測山羊痘的血清與抗體，但是實(shí)驗(yàn)背景高，且假陽性結(jié)果較高。隨后應(yīng)用皮膚活檢建立了免疫捕獲ELISA，該方法特異性能達(dá)到80%～100%，敏感性能達(dá)到70%～86%。1998年，建立了檢測山羊痘病毒的dot-ELISA檢測方法，通過dot-ELISA和CIEP兩種方法對西孟加拉的38個疑似羊痘病毒感染的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示dot-ELISA方法能檢出28份陽性，檢出率為68.4%，而CIEP能檢出21份陽性，檢出率為55.3%。用已知的陽性樣品作對照，dot-ELISA顯示100%的相關(guān)性，CIEP只有80%。dot-ELISA有較高的敏感性和特異性，并能用于野外診斷。2008年吳國華等［6］建立了羊痘病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，用該方法檢測羊傳染性膿皰病毒和口蹄疫病毒，顯示無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性，與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對比，其敏感性高4～8倍，可用于對山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測。

2 分子生物學(xué)診斷

基于臨床癥狀和血清學(xué)的診斷并不總是可靠的，所以為了克服這些限制，簡單、快速、特異地PCR技術(shù)成為檢測羊痘病毒并區(qū)分LSDV的有效手段。根據(jù)羊痘病毒的衣殼蛋白P32基因序列設(shè)計了相應(yīng)的引物，分別建立了檢測羊痘的PCR方法，成功的從樣品中擴(kuò)增出目的條帶。Markoulatos針對SPPV的ITR和α微管蛋白基因設(shè)計2對引物，建立了用于檢測皮膚組織中SPPV的多重PCR技術(shù)，該方法敏感性和特異性較好，24 h內(nèi)就可作出檢測，但偶爾會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Hosamani根據(jù)山羊痘病毒和綿羊痘病毒P32基因序列的差異，建立了區(qū)分GTPV和SPPV的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)。2010年，Lamien根據(jù)G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體基因建立了q-PCR方法，該方法使用雙雜交探針，根據(jù)熒光溶解曲線，可以種屬鑒別及基因分型。2008年，韓若嬋等［7］根據(jù)P32基因和末端反向重復(fù)序列基因片段設(shè)2對引物，建立多重PCR檢測方法，用此方法檢測口蹄疫病毒和羊口瘡病毒，結(jié)果均為陰性。2014年，趙志荀等［8］基于羊痘病毒的保守序列ITR設(shè)計三套引物，建立了區(qū)分綿羊痘和山羊痘的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)，并對48份綿羊痘感染樣品和87份山羊痘感染樣品進(jìn)行檢測，檢出率分別為100%和98.8%。

3 疫苗及免疫

3.1 血清接種 用發(fā)病并恢復(fù)健康的羊的血清或者抗羊痘病毒的血清接種羊，但是，其溫和的保護(hù)和血清免疫的失敗、致敏淋巴細(xì)胞，使之不能作為長期有效的免疫方法。

3.2 弱毒疫苗 1957年，我國袁慶志等［9］等通過將綿羊痘病毒在綿羊與雞胚之間交替?zhèn)鞔?，使病毒毒力減弱，并保持了良好的免疫原性。目前我國使用最多的仍然是沈榮顯分離的山羊痘病毒太原株經(jīng)雞胚減毒后的弱毒疫苗，命名為AV41疫苗株，該疫苗免疫動物后免疫持續(xù)期能到1年左右，既能抵抗山羊痘病毒感染又能抵抗綿羊痘病毒感染。印度研制的經(jīng)Vero細(xì)胞致弱的山羊痘病毒的活疫苗，接種102.5 TCID50的劑量，能提供4～6月齡的山羊52個月的保護(hù)［10］。肯尼亞綿羊山羊0240株是在自然條件下，同一個屬的病毒出現(xiàn)重組并分離得到的，此疫苗株能夠很好保護(hù)綿羊和山羊，在非洲的一些國家用于綿羊和山羊的接種免疫。但是弱毒疫苗存在免疫動物后毒力返強(qiáng)和散毒的風(fēng)險，因此非常有必要研制出更加安全有效的疫苗。

3.3 多肽疫苗 綿羊痘病毒的VP3蛋白被證明是免疫性蛋白，并且在兔體內(nèi)能引起高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫［11］。用弗氏不完全佐劑乳化的VP3蛋白免疫羊可誘導(dǎo)產(chǎn)生1∶256滴度的血清抗體，對免疫 VP3后接種病毒21 d的羊提供67%的保護(hù)［12］。羊痘病毒的另一種結(jié)構(gòu)蛋白－P32蛋白，是近些年的研究熱點(diǎn)，它有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，但是由于P32蛋白表達(dá)量低并且不穩(wěn)定，這在一定程度上制約著此方法的應(yīng)用前景。因此，找到另一種免疫原性更好，表達(dá)量、穩(wěn)定性更好的基因勢在必行。

3.4 活載體疫苗 隨著分子技術(shù)的發(fā)展，以羊痘病毒作為活載體的研究取得了一些進(jìn)展。羊痘病毒作為活載體有很多優(yōu)點(diǎn)，其基因組結(jié)構(gòu)明確，穩(wěn)定性強(qiáng)，基因組容量大，可容納至少25 Kb的外源基因而不失去感染力，有多個復(fù)制非必需區(qū)，對外源基因的插入耐受性強(qiáng)。羊痘病毒宿主范圍窄，只感染羊，對其他動物安全性高，并且能引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。Romero等［13］構(gòu)建的牛瘟病毒H基因的重組山羊痘病毒，動物試驗(yàn)顯示，體內(nèi)存在滴度較高的山羊痘病毒中和抗體和牛瘟病毒中和抗體。另外，Wade-Evans等［14］構(gòu)建表達(dá)了藍(lán)舌病VP7基因的重組羊痘病毒。Aspdcn等［15］構(gòu)建表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組羊痘病毒，作為復(fù)制缺陷型疫苗。Berhe等［16］構(gòu)建表達(dá)小反芻獸疫病毒F基因的重組羊痘病毒都有很好的效果。

4 討論

目前我國研究羊痘病毒的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研發(fā)出多個可以用于羊痘病毒診斷的分子和血清學(xué)診斷方法，但是各種原因，目前國內(nèi)尚沒有商品化的診斷試劑盒問世，所以推動羊痘病毒診斷的標(biāo)準(zhǔn)化勢在必行。

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，目前對羊痘病毒基因的理解也更加深入。羊痘病毒毒力基因、宿主范圍基因和宿主之間的關(guān)系等基礎(chǔ)研究的深入，為研發(fā)新的檢測方法和疫苗提供了依據(jù)。另外，羊痘病毒作為活病毒載體有著眾多優(yōu)點(diǎn)，研發(fā)羊痘病毒活載體為基礎(chǔ)的多價疫苗是今后一個重要的研究方向。

由于羊痘目前僅在亞洲和非洲發(fā)展中國家和落后國家大規(guī)模流行，歐洲早已消滅了羊痘病毒，因此發(fā)達(dá)國家對羊痘的研究較少。羊痘病毒的免疫和致病機(jī)制的研究幾乎是空白，因此，要加強(qiáng)和推動羊痘病毒的基礎(chǔ)研究，為羊痘的診斷、疫苗的研發(fā)和疾病的控制奠定基礎(chǔ)。

［1］ Bhambani B D，Krishnamurthy D．An immunodiffusion test for laboratory diagnosis of sheep pox and goatpox［J］．J Comp Pathol，1963，73:349-357．

［2］ Rao T V S，Poonam Malik，Asgola D．Evaluation of avidin-biotin ELISA for the detection of antibodies to goat poxvirus using noninfectious diagnostic reagent［J］．Acta Virologica，1999，43: 297-301．

［3］ Soman J P．Antigenic detection ofsheep poxvirus in the sheep kidney and testes cell cultures by immunoflourescent test［J］．Indian Vet J，1986，63(10):793-795．

［4］ 王開功，虞天德，何光志，等．應(yīng)用反向間接血凝試驗(yàn)檢測山羊痘病毒抗原［J］．山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2005，24(1):29-32．

［5］ Sharma S N，Negi B S．Yadav M P，et al．Application of ELISA in the detection ofgoatpox antigen and antibodies［J］．Acta Virologica，1988，32:65-69．

［6］ 吳國華，張強(qiáng)，顏新敏，等．羊痘病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立［J］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(5):860-864．

［7］ 韓若嬋，張強(qiáng)，吳國華，等．羊痘病毒多重PCR檢測方法的建立［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(3):206-208．

［8］ Zhao Z，F(xiàn)an B，Wu G，etal．Developmentof loop-mediated isothermal amplification assay for specific and rapid detection of differential goat Pox virus and Sheep Pox virus［J］．Bmc Microbiology，2014，14(1):1-10．

［9］ 袁慶志，李寶啟，沈榮顯．羊痘弱毒疫苗的研究——第一報羊痘病毒雞胚培養(yǎng)的研究［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1957，2(1): 15-23．

［10］ Hosamani M，Nandi S，Mondal B，et al．A Vero cell-attenuated Goatpox virus provides protection againstvirulentvirus challenge．［J］．Acta Virologica，2004，48(1):15-21．

［11］ Rai A，Singh U S，Pandey K D，et al．Characterization of an immunogenic viral protein of sheep poxvirus［J］．Indian J Virol，1985，1(2):120-126．

［12］ Rai A，Goel A C，Pandey K D，et al．Immunogenicity of a virion polypeptide ofsheep poxvirus in sheep［J］．Indian J Virol，1986，2(1):11-15．

［13］ Romero C H，Barrett T，Kitching R P，et al．Protection of cattle against rinderpest and lumpy skin disease with a recombinant capripoxvirus expressing the fusion protein gene of rinderpest virus．［J］．Veterinary Record，1994，135(7):152-154．

［14］ Wade-Evans A M，Romero C H，Mellor P，et al．Expression of the major core structural protein(VP7)of bluetongue virus，by a recombinant capripox virus，provides partial protection of sheep againsta virulentheterotypic bluetongue virus challenge［J］．Virology，1996，220(1):227-231．

［15］ Aspden K，Passmore J A，Tiedt F，et al．Evaluation of lumpy skin disease virus，a capripoxvirus，asa replication-deficient vaccine vector．J Gen Virol84:1985—1996［J］．Journalof General Virology，2003，84(Pt8):1 985-1 996．

［16］ Berh e G，M inet C，Goff C L，etal．Developmentofa dualrecombinant vaccine vaccine to protect small ruminant against pestedes-petits-ruminant virus and capripoxvirus inefctious［J］．Virology，2003，77:1 571-1 577．

S852.65+4

A

0529-6005(2017)06-0086-03

2016-07-19

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃課題(2016YFD0500907);甘肅省國際科技合作專項(xiàng)(1604WKCA012);甘肅省國際科技合作專項(xiàng)(1504WKCA055)

李楊(1990-)，男，碩士生，研究方向?yàn)榉肿用庖吲c環(huán)境控制，E-mail:843290952@qq．com

顏新敏，E-mail:qzhang1616@sohu．com;張強(qiáng)，E-mail: qzhang1616@sohu．com