姜永生，楊 琳

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710004)

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UGT1A6 A541G基因多態(tài)性對癲癇兒童丙戊酸鈉血藥谷濃度的影響

姜永生，楊 琳

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710004)

目的 探討尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)1A6 A541G基因多態(tài)性對丙戊酸鈉血藥谷濃度的影響。方法 患兒服藥至少5個半衰期后，丙戊酸鈉血藥谷濃度達到穩(wěn)態(tài)時采集靜脈血，全血基因組DNA提取后經(jīng)PCR擴增目標(biāo)基因，使用焦磷酸測序技術(shù)檢測UGT1A6 A541G基因多態(tài)性，同時氣相色譜法測定丙戊酸鈉血藥谷濃度。結(jié)果 在67例患兒中，UGT1A6 A541G基因型為A/A者49例(73.1%)，A/G者17例(25.4%)，G/G者1例(1.5%)，根據(jù)基因型分為A組(A/A者)和B組(A/G者和G/G者)。B組患兒丙戊酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度均值(3.43±0.38)mg/mL較A組(4.13±0.21)mg/mL低，結(jié)果有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(t=2.51，P<0.05)。結(jié)論 UGT1A6 A541G基因多態(tài)性影響丙戊酸鈉的代謝與排泄，提示含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒口服丙戊酸鈉應(yīng)高于常規(guī)用量。

UGT1A6 A541G基因多態(tài)性；丙戊酸鈉；癲癇；兒童

丙戊酸鈉是目前臨床上最常用的一線抗癲癇藥物之一，臨床發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉的用藥劑量和血藥谷濃度存在很大的個體差異，部分患兒即使應(yīng)用較小劑量，其血藥谷濃度仍會超過有效血藥谷濃度范圍。臨床上需要對其進行血藥谷濃度監(jiān)測，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果和療效來調(diào)整藥物的使用劑量，從而提髙其療效同時降低不良反應(yīng)的發(fā)生。藥物的代謝主要受藥物代謝酶影響，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶 (uridine diphosphoglucuronyl transferase，UGT)是丙戊酸相代謝酶。UGT A541G基因具有多態(tài)性而導(dǎo)致酶的活性改變，UGT1A6 A541G基因多態(tài)性可能通過影響酶的活性而影響丙戊酸鈉的血藥谷濃度[1]。本研究旨在調(diào)查UGT1A6 A541G基因多態(tài)性在癲癇患兒中的分布，探討基因多態(tài)性與丙戊酸鈉血藥谷濃度個體差異的關(guān)系。

1資料和方法

1.1研究對象

收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科2015年11月至2016年4月住院癲癇患兒相關(guān)臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：服用丙戊酸鈉口服液且已完善UGT A541G基因多態(tài)性分析、丙戊酸鈉血藥谷濃度檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：口服兩種及以上抗癲癇藥物；聯(lián)合生酮飲食治療；聯(lián)合激素治療；檢測血藥濃度期間合并肝、腎功能檢測異常；合并其他遺傳代謝疾病。

共收集67例活動性癲癇患兒資料，其中男性患兒38人，女性患兒29人，最小年齡2歲，最大年齡13歲；服用丙戊酸鈉的劑量為10～30mg·kg-1·d-1，分3次服用，服用丙戊酸鈉的總療程為5天至3年。

1.2標(biāo)本采集

服藥至少5個半衰期后，丙戊酸鈉血藥谷濃度達到穩(wěn)態(tài)時采集靜脈血，早晨空腹服藥前采靜脈血4mL，其中2mL置普通試管以測定丙戊酸鈉血藥谷濃度,另外2mL置無菌無酶的EDTA抗凝試管中4℃保存。

1.3尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A6 A541G基因多態(tài)性檢測

1.3.1人血標(biāo)本DNA提取

采用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取結(jié)束后加入預(yù)熱65℃洗出液150μL溶解DNA，放置過夜，待用。

1.3.2聚合酶鏈反應(yīng)

設(shè)計并合成UGT1A6 A541G擴增和測序的引物，按如下條件進行PCR擴增：PCR體系50μL。10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP)4μL(各10mmol/L)，蒸餾水37.5μL，正向引物和負(fù)向引物各0.5μL(100μmol/L)，rTaq DNA多聚酶0.5μL(5IU/μL)，基因組DNA2.0μL(20～30μg/L)。PCR條件為94℃預(yù)變性10min，變性、退火和延伸分別為94℃30s、55℃30s和72℃45s，共50個循環(huán)，最后72℃延伸 7min，最后在4℃保溫。取擴增產(chǎn)物5μL和上樣緩沖液1μL混勻，在2%瓊脂糖電泳，可獲得清晰的擴增產(chǎn)物[2]。

1.3.3焦磷酸測序

①測序引物退火緩沖液的配制：將10μmol/L測序引物工作液1μL加入24μL退火緩沖液中，得到0.4μmol/L測序引物退火緩沖液。測序板上每個孔加入測序引物退火緩沖液25μL；②配置單鏈DNA分離液：2μL磁珠和40μL結(jié)合緩沖液，加高純水18μL配置成60μL單鏈DNA分離液；③PCR產(chǎn)物固定：每個PCR樣本20μL加入60μL單鏈DNA分離液，在常溫下劇烈振蕩10min，使得親和素包被的磁珠與生物素標(biāo)記的單鏈充分結(jié)合；④單鏈DNA模板的制備：在真空工作站中，1號位加入70%乙醇50mL，2號位加入變性緩沖液40mL，3號位加入洗液50mL，4號位加入高純水50mL，5號位加入高純水70mL，打開真空泵，將真空工具在6號位清洗15s，移動到PCR板吸附磁珠15s，依次在1、2、3號位清洗5s、5s、10s；⑤引物雜交：將真空工具真空閥關(guān)閉，放入含有測序引物的板中，充分搖動釋放磁珠，在80℃雜交2min，室溫靜置5min冷卻；⑥測序：使用焦磷酸測序儀和測序通用試劑盒，按儀器和試劑說明書進行PCR產(chǎn)物的SNP位點的焦磷酸測序[2]。

1.4丙戊酸鈉血藥谷濃度測定及其標(biāo)準(zhǔn)化

氣相色譜法測定丙戊酸鈉血藥谷濃度(μg/mL)。為消除體重及服藥劑量對血藥谷濃度的影響，將氣相色譜法所測得血藥谷濃度除以患兒每日每千克體質(zhì)量的服藥量(mg/kg)，即標(biāo)準(zhǔn)化的血藥谷濃度[3]。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，UGT1A6 541位點的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡及基因多態(tài)性分布的差異用χ2檢驗[4]，UGT1A6 541位點A/A、A/G、G/G基因型間血藥谷濃度差異的分析用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。定義P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1研究對象的基因型分析

67例癲癇患兒A、G的等位基因頻率分別為85.8%和14.2%，其基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.84，P>0.05)。67例患兒UGT1A6 541位點基因型為A/A者49例(73.1%)，A/G者17例(25.4%)，G/G者1例(1.5%)。

2.2基因多態(tài)性與丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度的關(guān)系

UGT1A6 541位點A/A基因型與含有UGT1A6 541位點G等位基因的患兒丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度的比較：根據(jù)上述基因分型將UGT1A6 541野生型(即A/A基因型)的患兒作為A組，含UGT1A6 541突變型的患兒(包括A/G者和G/G者)作為B組。B組患兒丙戊酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度均值(3.43±0.38)mg/mL較A組(4.13±0.21)mg/mL低，見表1。

分組例數(shù)(n) 性別 男(n)女(n)標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度平均值(mg/mL)A組4927224．13±0．21B組181173．43±0．38

3討論

雖然血藥谷濃度監(jiān)測對臨床個體化給藥起著一定的作用，但不能在用藥前預(yù)測機體對藥物的反應(yīng)，常需頻繁監(jiān)測血藥谷濃度間接了解患兒的藥物代謝水平，造成初始加量時間偏長，長期維持劑量可能波動較大，藥物基因組學(xué)為個體化給藥的嘗試提供了一個新的方法。分析患者的藥物基因組學(xué)，結(jié)合病人的病理生理特征、臨床表型，制定合理、安全、有效的用藥方案，真正做到個體化給藥，達到藥物有效性及安全性目的，是未來精準(zhǔn)醫(yī)療的一個方向。

3.1尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A6 A541G基因多態(tài)性檢測有助于指導(dǎo)癲癇兒童丙戊酸鈉使用

丙戊酸經(jīng)胃腸道吸收，隨血流透過血腦屏障作用于神經(jīng)元相應(yīng)的靶點，大部分由肝臟代謝，包括與UGT結(jié)合，主要由腎臟排出體外，整個過程涉及受體及各種酶的基因變異，從而影響藥物的吸收、分布和代謝，最終影響藥物的臨床療效[5]。葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶作為肝臟重要的代謝酶，其基因多態(tài)性研究近來備受關(guān)注，本研究中癲癇患兒中UGT1A6 A541G多態(tài)性的分布結(jié)果，A541G位點突變發(fā)生率為26.9%，與亞裔人群的突變頻率基本一致，與非裔美國人群的突變頻率也基本一致[6-7]。目前研究認(rèn)為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)基因的雜合子突變型及突變型可加快藥物的代謝與排泄，從而造成攜帶UGT1A6突變基因型的患者體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度較野生基因型低[7-8]，對指導(dǎo)臨床合理、安全、個體化調(diào)整藥物有一定作用。本研究結(jié)論與相關(guān)文獻報道相一致，支持含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒加快了藥物的代謝與排泄，從而在臨床使用丙戊酸鈉時應(yīng)較常規(guī)加大用量。

3.2現(xiàn)階段臨床應(yīng)用尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A6 A541G基因多態(tài)性檢測的局限性

丙戊酸的代謝過程相當(dāng)復(fù)雜，除UGT1A6參與丙戊酸的代謝過程外，UGT1A9、UGT2B7等其他 Ⅱ相代謝酶也有協(xié)同效應(yīng)，丙戊酸代謝也受到諸如CYP2A6、CYP2B6Ⅰ相代謝酶及脂肪酸結(jié)合蛋白的影響[4,9]。諸如年齡、種族、營養(yǎng)狀況(血漿蛋白水平)以及胃、腸、肝、腎功能等因素對藥物吸收、分布、代謝、排泄的影響較大，進而影響丙戊酸鈉血藥濃度。含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒使用丙戊酸鈉時較常規(guī)增大用量的具體數(shù)值尚需摸索。因此目前基因多態(tài)性檢測結(jié)果指導(dǎo)抗癲癇治療方案調(diào)整尚待進一步深入研究。

綜上所述，本實驗中攜帶UGT1A6突變基因型的患兒體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)血藥谷濃度較野生基因型低，支持含有UGT1A6 A541G等位基因的癲癇患兒丙戊酸鈉代謝與排泄速率加快，提示含有UGT1A6 A541G等位基因的患兒口服丙戊酸鈉應(yīng)高于常規(guī)用量。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：周戩平]

Effect of UGT1A6 A541G genetic polymorphism on serum concentration of sodium valproate in children with epilepsy

JIANG Yong-sheng, YANG Lin

(Department of Pediatrics, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710004, China)

Objective To evaluate the effect of uridine diphosphoglucuronyl transferase (UGT) 1A6 A541G genetic polymorphism on serum concentration of sodium valproate. Methods Venous blood of epileptic children with serum concentration of sodium valproate reaching steady state after at least 5 half-lives was collected. Target gene was amplified by PCR after whole blood genomic DNA extraction, and UGT1A6 A541G gene polymorphism was detected by pyrosequencing. Method of gas chromatography was used to assay serum concentration of sodium valproate. Results The genotypic frequencies of UGT1A6 A541G were as follows: A/A in 49 cases (73.1%), A/G in 17 cases (25.4%) and G/G in 1 case (1.5%). According to the genotypes of UGT1A6 A541G the patients were divided into two groups, group A (A/A) and group B (A/G and G/G). Mean value of serum concentration of sodium valproate of patients in group A (4.13±0.21mg/mL) was higher than that in group B (3.43±0.38mg/mL) with statistical significance (t=2.51,P<0.05).Conclusion The genetic polymorphism of UGT1A6 A541G affects metabolism and excretion of sodium valproate, which indicates that the dosage of sodium valproate for patients with UGT1A6 A541G allele should be higher than usual.

UGT1A6 A541G genetic polymorphism; sodium valproate; epilepsy; children

2016-6-20

姜永生(1984-)，男，住院醫(yī)師，碩士，主要從事兒童癲癇臨床診療。

楊 琳，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.032

R725

A

1673-5293(2016)12-1526-03