高莉媛, 王艷龍, 陳軍輝, 王 帥, 史小星, 石洪華, 鄭 立, 2

?

高效液相色譜-離子阱質譜法測定海洋微藻藻粉中的8種脂溶性毒素

高莉媛1, 王艷龍1, 陳軍輝1, 王 帥1, 史小星1, 石洪華1, 鄭 立1, 2

(1. 國家海洋局第一海洋研究所, 山東青島266061; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室, 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室, 山東青島 266071)

建立了利用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜(HPLC-ESI-IT-MS)測定海洋微藻藻粉中8種典型脂溶性毒素的分析方法。藻粉樣品經超聲細胞破碎后, 采用超聲波輔助提取法對藻毒素進行提取, 用HPLC-ESI-IT-MS多反應離子監(jiān)測(MRM)模式對各種毒素(包括大田軟海綿酸(OA)、鰭藻毒素1(DTX-1)、扇貝毒素2(PTX-2)、蝦夷扇貝毒素(YTX)、原多甲藻酸1(AZA1)原多甲藻酸2(AZA2)、羅環(huán)內酯毒素(SPX), 米氏裸甲藻毒素(GYM))進行測定。8種脂溶性藻毒素均在線性范圍內線性關系良好(2均在0.991以上), 檢出限均介于0.085~1.315 pg之間, 加標回收率在88.5%~111.4%之間, 方法重復性相對標準偏差(RSD)在4.82%~10.17%范圍。應用該方法對利瑪原甲藻干藻粉中的毒素進行了測定, 分析結果良好, 說明本方法是海洋微藻藻粉中脂溶性藻毒素測定的有效方法。

高效液相色譜-離子阱質譜; 腹瀉性貝毒; 海洋微藻

海洋微藻是海洋生態(tài)系統中的最主要初級生產者, 具有種類多、數量大、繁殖速度快等特點, 在海洋生態(tài)系統的物質循環(huán)和能量流動中起著極其重要的作用[1]。海洋微藻也是一類十分重要的海洋生物資源, 許多海洋微藻含有豐富的蛋白質、天然維生素、礦物質、不飽和脂肪酸、多糖以及其他結構獨特的初級或次級代謝產物。近幾十年來, 人們逐漸注重海洋微藻資源開發(fā), 在生物質能源、食品保健品、醫(yī)藥和禽畜養(yǎng)殖業(yè)等方面得到了廣泛的開發(fā)和利用[2-4]。然而, 在種類眾多的海洋微藻中, 有些海洋微藻可以產生生物毒素, 這些生物毒素可以引起人類產生麻痹性、痢疾性、神經性和溶血性等中毒癥狀[5]。迄今為止, 已發(fā)現的海洋微藻生物毒素及其衍生物約有200多種[6], 按溶解性質可分為水溶性毒素和脂溶性毒素, 其中脂溶性毒素約占90%, 在全球范圍內分布廣泛, 影響巨大。在這些脂溶性毒素中, 特別是大田軟海綿酸 (OA)及其衍生物(DTXs), 蝦夷扇貝毒素(YTXs), 原多甲藻酸(AZAs), 扇貝毒素 (PTXs), 和羅環(huán)內酯毒素 (SPXs)等脂溶性毒素較為常見, 因此, 建立針對干藻粉中多種典型脂溶性藻毒素進行檢測的高效方法, 并用于海洋微藻藻粉中常見脂溶性藻毒素的檢測, 對保障以藻粉為原料開發(fā)的食品、保健品或飼料產品的食用安全性具有重要意義。

用于脂溶性藻毒素檢測的分析方法有小白鼠生物分析法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等[7]。其中LC-MS/MS法靈敏度高、選擇性好, 是最理想的脂溶性藻毒素檢測方法。目前, 該方法已用于海產品[8]、海洋赤潮藻[9-10]、海水[11]中多種脂溶性藻毒素的測定, 而針對海洋微藻干藻粉的檢測研究鮮有報道。本研究以8種常見典型脂溶性藻毒素為目標化合物, 通過對樣品前處理實驗條件及 HPLC-ESI-IT-MS分析條件的優(yōu)化, 建立了適用于海洋微藻干藻粉中8種典型脂溶性藻毒素同步測定的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

1200型高效液相色譜儀, 配有四元泵, 可變波長檢測器(VWD), 自動進樣器等(美國Agilent公司); 6320型離子阱質譜儀, 配有電噴霧(ESI)離子源(美國Agilent公司); KQ-400KDE型高功率數控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司); R201型旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司); Himac CR22GII 高速大容量冷凍離心機(日本HITACHI公司); BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius公司); Milli-Q(18.2 MΩ) 超純水處理系統(美國Millipore 公司); JY92-IIDN型超聲細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

AZA1、AZA2、SPX1、DTX1、OA、YTX、PTX2和GYM標準備品(購于加拿大國家海洋研究中心), 質譜純氨水(Fluka公司); 色譜純乙腈和甲醇(美國ACS公司); 水為自制Milli-Q超純水。實驗所用含有毒素的利瑪原甲藻(干藻粉)(含有OA和DTX-1兩種毒素)和不含毒素的干藻粉(作為樣品空白), 均為實驗室內培養(yǎng)獲得海洋微藻藻體, 然后通過冷凍干燥得到干藻粉。

1.2 對照品溶液的配置

取8種毒素(OA、YTX、DTX-1、AZA1、AZA2、GYM、SPX1、PTX2)標準品各1瓶(0.5 mL), 分別用甲醇稀釋后轉移至5 mL容量瓶中準確定容, 振蕩搖勻, 得到8種典型脂溶性毒素標準儲備液(單標)。按照一定的比例分別吸取相應的毒素OA、YTX、DTX-1、AZA1、AZA2、GYM、SPX1和 PTX2單標儲備液, 置于10 mL容量瓶中并用甲醇稀釋定容, 得8種典型毒素的混合標準儲備液, 其中OA、YTX、DTX-1、AZA1、AZA2、GYM、SPX1、PTX2濃度分別為6.843、26.30、25.77、123.7、25.66、5.003、56.42、3.436 μg/L, 所有混標溶液置于–20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品溶液制備

準確稱取一定量的海洋微藻干藻粉, 置于10 mL離心管中, 加入6 mL甲醇, 首先采用超聲破碎儀細胞破碎3 min, 再采用超聲輔助提取30 min, 然后以5000 r/min的轉速離心15 min, 將藻體與上清液分離, 再對藻體進行第二次超聲輔助提取30 min, 合并兩次提取液, 定容到25 mL的容量瓶中, 吸取1 mL 定容液經0.22 μm濾膜過濾并注入樣品瓶中, 進樣前根據藻粉中毒素的含量對樣品溶液進行適當稀釋, 確保樣品濃度落在線性范圍之內。

1.4 色譜質譜條件

液相色譜條件: 采用ZORBAX Extend-C18色譜柱(3 mm×150 mm, 3.5mm, 美國Agilent公司), 流動相A為純水, B為90%的乙腈(均含有6.6 mmoL/L的氨水), 二元梯度淋洗: T: 0-15-20-45-48 min, 流動相B%: 20%-30%-47.5%-100%-20%, 流速: 0.4 mL/min, 進樣體積為10 μL, 柱溫: 室溫(20℃±2℃)。

質譜條件: 電噴霧電離源, 霧化氣壓力(N2)40 psi, 干燥氣(N2)流速11 L/min, 干燥氣溫度350℃, 毛細管電壓4000V, 質量掃描范圍100~1300。根據各組分的色譜保留時間和一級、二級質譜特征優(yōu)化質譜參數, 按時間分段用多反應離子監(jiān)測(MRM)模式對各組分進行質譜檢測; OA、PTX-2、SPX1、AZA1、AZA2、GYM采用正離子模式(ESI+); DTX-1和YTX采用負離子模式(ESI-), 各化合物的保留時間、MRM選擇離子以及目標離子、碰撞能量等參數見表1。

1.5 定性定量方法

通過比較藻粉樣品與毒素標準溶液的提取離子色譜 (EIC)峰保留時間及二級質譜圖的特征定性離子和定量離子進行目標化合物的定性。藻粉樣品中目標化合物二級質譜分析特征離子與標準品二級質譜特征離子相吻合。采用基質標準曲線, 以外標法對藻粉樣品中的毒素進行定量。在MRM模式下選擇定量離子計算目標化合物EIC峰面積, 代入線性曲線計算樣品濃度。試樣溶液中待測物的響應值均應在本方法線性范圍內。

表1 8種脂溶性藻毒素離子阱質譜分析(MRM模式)參數

2 結果與討論

2.1 色譜質譜條件優(yōu)化

在前期研究中[11], 采用HPLC-ESI-IT-MS實現了對海水中3種典型脂溶性毒素的有效分離和檢測, 該方法采用堿性流動相分離體系, 據文獻[12]報道, 堿性流動相分離體系有利于提高不同系列脂溶性毒素的分離。在此基礎之上, 選用堿性流動相(pH為11)分離體系, 通過對梯度洗脫程序的進一步優(yōu)化, 獲得了適用于海洋微藻藻粉中8種典型脂溶性藻毒素有效分離的色譜條件, 在最佳色譜分離條件下, 對8種典型脂溶性藻毒素混合標準品進行了一級質譜全掃描分析, 然后, 以MRM模式二級質譜分析定量離子的靈敏度為評價指標, 對二級質譜分析條件進行了進一步優(yōu)化, 以確定各化合物定量分析的最佳儀器參數(表1), 各化合物MRM模式二級質譜分析EICs見圖1, 可以看出各化合物分離良好。

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

為了保證樣品提取優(yōu)化結果能反映微藻藻粉樣品中毒素的真實提取效率, 本研究使用含有OA和DTX-1毒素的干藻粉樣品, 以OA和DTX-1的提取效率為評價指標, 采用單因子實驗法, 對提取條件進行優(yōu)化。

在樣品提取過程中選擇合適的提取溶劑既能促進目標化合物的提取, 又能消除一些不必要的干擾基質的影響。根據脂溶性藻毒素的化學性質, 選取了6種提取劑(異丙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、丙酮)在室溫(25℃±2℃)條件下超聲波輔助提取30 min, 對微藻藻粉中的OA和DTX-1毒素進行了提取。提取結果(圖2)顯示, 甲醇對這2種脂溶性藻毒素的總體提取效果最好, 要明顯高于其它提取溶劑, 所以選擇甲醇作為提取劑。

在提取過程中為了降低藻細胞壁對目標化合物包裹的影響, 使目標毒素提取效果更充分, 考察了在提取之前增加超聲細胞破碎處理對2種毒素提取效果的影響。實驗結果表明, 當細胞破碎時間達到3?min時, 2種目標毒素能得到充分提取, 與不采用細胞破碎處理相比, 2種目標化合物的提取率分別增加了34.93%和30.19%, 說明微藻細胞壁的存在會影響細胞內毒素的溶出, 因此, 有必要在提取過程中增加細胞破碎處理。

在以上的提取條件下通過一次超聲提取, 目標化合物并不能得到完全提取, 因此, 考察了不同提取次數對提取效果的影響, 結果如表2所示。可以看出當提取2次后, 兩種毒素提取效率均達到98.0%以上, 為了節(jié)約提取時間和提取溶劑, 最后選擇超聲提取2次。

2.3 方法學考察

2.3.1 儀器精密度

取毒素的混合標準品溶液于進樣小瓶中, 連續(xù)進樣6次, 每次進樣10 μL, 得到各化合物提取離子峰的峰面積及保留時間, 算出6次進樣分析的峰面積及保留時間的相對標準偏差(RSD), 8個化合物峰面積RSD均小于等于9.57%, 保留時間的RSD均小于等于1.20%, 說明儀器方法具有較好的精密度。

表2 提取次數對兩種脂溶性藻毒素提取效率的影響(n=3)

2.3.2 專屬性

在最佳的實驗條件下, 測定甲醇, 空白藻粉, 以及加入毒素混合標準品溶液的空白藻粉, 結果只在添加了脂溶性藻毒素標準品的藻粉樣品中檢測出了8種脂溶性藻毒素, 說明該方法具有良好的專屬性。

2.3.3 基質效應

海洋微藻粉成分復雜, 其中包含的雜質可能會影響目標分析物的離子化效率, 造成目標化合物質譜信號的抑制或增強, 影響方法檢測的靈敏度和結果的準確性。為了評價粗提液中基質對目標化合物質譜分析的影響, 采用空白藻粉樣品的提液配制8種脂溶性藻毒素混標, 以甲醇配制的同一濃度水平的混合標準溶液作為對比, 通過MS/MS分析測得各目標化合物的峰面積?；|效應(ME)按公式計算:

(%)=(s–x)/s×100 (1)

式中,x為空白藻粉提取液配制毒素混標中目標化合物的峰面積;s表示相同濃度水平甲醇配置標準溶液中毒素的峰面積?；|效應實驗結果見表3, “–”表示信號增強, “+”表示信號抑制, 基質對YTX和GYM檢測的影響較大, 對GYM 的信號抑制率為27.01%, 對YTX 的信號增強率為29.47%, 而對其他6種毒素的影響相對較小(均未超過7.19%)。說明藻粉提取液中的基質組分對各目標化合物有不同程度的抑制作用, 基質影響不可忽略。

2.3.4 檢出限和標準曲線

由于基質效應不可忽視, 標準品在甲醇溶液中的質譜響應與其在實際樣品基質中的響應不同, 因此, 采用基質標準曲線外標法對目標化合物進行定量, 以降低基質效應對測定結果準確度的影響。取8種脂溶性毒素混合標準溶液, 使用空白干藻粉提取液對其進行梯度稀釋, 稀釋倍數分別為1、2、5、10、20、50、100, 獲得基質標準溶液。以所測毒素的峰面積為縱坐標, 所測毒素的質量為橫坐標繪制定量標準曲線。將信噪比為3對應的質量作為方法的檢出限(LOD), 信噪比為10對應的質量作為方法的定量限(LOQ)。

表3給出了8種毒素的線性范圍、回歸方程、相關系數、LOD、LOQ等。從表3結果可以看出, 各種毒素相關系數(2)均大于0.991, 表明各化合物在定量線性范圍內線性關系良好, 能對目標化合物準確定量。整體而言方法的靈敏度能滿足實際藻粉樣品測定的靈敏度要求。

表3 線性范圍、靈敏度、重復性、回收率和基質效應實驗結果

2.3.5 回收率和重復性

方法回收率的測定采用標準加入法, 平行稱取6份空白藻粉樣品, 分別添加一定量的毒素標準品(OA: 1.0 μg, YTX: 4.0 μg, DTX-1: 4.0 μg, AZA1: 4.0 μg AZA2: 1.0 μg, GYM: 1.0 μg SPX1: 1.0 μg, PTX-2: 2.0 μg),然后按2.3節(jié)樣品溶液的制備方法處理, 用2.4節(jié)色譜-質譜條件測定加標回收率和重復性, 測定結果見表3, 可以看出, 8種毒素的回收率在88.5%~111.4%之間, 重復性 RSD在4.82%~10.17%范圍內, 表明該方法具有較好的回收率和重復性, 能滿足實際干藻粉樣品中各種脂溶性藻毒素的測定要求。

2.4 利瑪原甲藻藻粉中毒素含量測定

采用已建立的分析方法, 對實驗室內培養(yǎng)獲得的利瑪原甲藻干粉進行檢測, 干藻粉中OA和DTX-1的HPLC-ESI-IT-MS分析提取離子流圖見圖3, 對應的二級質譜圖見圖4, 由圖3和圖4可以看出干藻粉提取液中OA和DTX-1的保留時間以及二級質譜圖與標準對照品一致, 說明干藻粉中檢測到的這兩個化合物為OA和DTX-1。干藻粉中OA和DTX-1定量結果表明, 干藻粉中OA的含量為0.33 mg/g, DTX-1的含量為0.26 mg/g, 表明利瑪原甲藻干粉中這兩種脂溶性藻毒素含量較高。OA和DTX-1是典型的腹瀉性藻毒素, 人類食用含有這兩種毒素的食物后會引起腹瀉、腹痛等腸胃疾病[8]。因此, 用于食品、保健品和醫(yī)藥產品開發(fā)的海洋微藻中即使含有少量有毒藻, 也會對人類健康造成威脅, 而針對干藻粉中多種脂溶性藻毒素進行檢測, 對降低人類中毒風險具有重要意義。

A. OA標準品; B.藻粉提取液中OA; C. DTX-1標準品; D. 藻粉提取液中DTX-1

A. OA standard; B. OA in the crude extract of microalgae powder; C. DTX-1 standard; D. DTX-1 in the crude extract of microalgae powder

3 結論

建立了一種高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜檢測海洋微藻干藻粉中8種脂溶性毒素的方法, 該方法操作簡單、回收率高、重復性好, 具有較強的適用性, 對于海洋微藻干藻粉中8種脂溶性毒素檢測能提供可行的方法。

[1] 高亞輝, 荊紅梅, 黃德強, 等. 海洋微藻胞外產物研究進展[J]. 海洋科學, 2002, 26(3): 35-38. Gao Yahui, Jin Hongmei, Hong Deqiang, et al. Advances in studies on extracellular products of marine microalgae[J]. Marine Sciences, 2002, 26 (3): 35-38

[2] 張建民, 劉新寧. 海洋微藻的利用現狀和開發(fā)前景[J]. 齊魯漁業(yè), 2006, 23(4): 6-8. Zhang Jianmin, Liu Xinning. Utilization status and development prospects of marine microalgae[J]. Shandong Fisheries, 2006, 23(4): 6-8.

[3] 彭文嵐, 王廣建, 孫宗彬. 微藻在能源、環(huán)保及食品保健中的應用[J]. 化工科技市場, 2010, 33(2): 18-21.Peng Wenlan, Wang Guangjian, Sun Zongbin. Application of micro-alage in energy, environmental protection, and health food[J]. Chemical Technology Market, 2010, 33(2): 18-21.

[4] 馬吉鋒, 楊淼, 黎玉瓊, 等. 鹽藻粉及其在動物生產中的應用研究進展[J]. 畜牧與飼料科學, 2012, 33(9): 52-54. Ma Jifeng, Yang Miao, Li Yuqiong, et al. Research progress onpowder and its appliaction in animal production[j]. Animal husbandry and Feed Science, 2012, 33(9): 52-54.

[5] 江紅霞, 鄭怡. 微藻的藥用、保健價值及研究開發(fā)現狀[J]. 亞熱帶植物科學, 2003, 32(1): 68-72. Jiang Hongxia, Zheng Yi. A review of pharmaceutical and health care value of microalgae and their current status of research and development[J]. Subtropical Plant Science, 2003, 32(1): 68-72.

[6] Arjen Gerssen, Patrick PJ. Mulder, Jacob de Boer. Screening of lipophilic marine toxins in shellfish and algae: Development of a library using liquid chromato-graphy coupled to orbitrap mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2011, 685(2): 176-185.

[7] 譚志軍, 吳海燕, 郭萌萌, 等. 脂溶性貝類毒素安全評價與檢測技術研究進展[J]. 中國水產科學, 2013, 20(2): 467-479.Tan Zhijun, Wu Haiyan, Guo Mengmeng, et al. Progress in risk assessment and detection method of lipophilic phycotoxins[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(2): 467-469.

[8] 姚建華, 譚志軍, 周德慶. 液相色譜-串聯質譜檢測貝類組織中5種脂溶性貝毒素[J]. 分析化學, 2010, 38(12): 1714-1720. Yao Jianhua, Tan Zhijun, Zhou Deqing. Determination of five lipophilic marine toxins in shellfish by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J]. Chinese Jounal of Analytical Chemistry, 2010, 38(12): 1714-1720.

[9] Toshiyuki Suzuki , Akira Miyazono, Katsuhisa Baba, et al. LC–MS/MS analysis of okadaic acid analogues and other lipophilic toxins in single-cell isolates of several Dinophysis species collected in Hokkaido, Japan[J]. Harmful Algae, 2009, 8(2): 233-238.

[10] 羅璇, 于仁成, 周明江.應用LC-MS聯用方法分析青島近海漸尖鰭藻(Dinophysis acuminata)細胞中的毒素成分[J]. 海洋環(huán)境科學, 2014, 33(5): 781-787. Luo Xuan, Yu Rencheng, Zhou Mingjiang. Analysis of toxins in cells ofcollected from coastal waters of Qingdao LC-MS method[J]. Marine Environmental Science, 2014, 33(5): 781-787.

[11] Li Xin, Li Zhaoyong, Chen Junhui, et al. Detection, occurrence and monthly variations of typical lipophilic marine toxins associated with diarrhetic shellfish poisoning in the coastal seawater of Qingdao City, China[J]. Chemosphere, 2014, 111: 560-567.

[12] Gerssen A, Mulder P PJ., McElhinney M A, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkaline conditions[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(9): 1421-1430.

Determination of eight typical lipophilic algae toxins in marine microalgae powder using high-performance liquid chromato-graphy-ion trap mass spectrometry

GAO Li-yuan1, WANG Yan-long1, CHEN Jun-hui1, WANG Shuai1, SHI Xiao-xing1, SHI Hong-hua1, ZHENG Li1, 2

(1. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China; 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

A method involving high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization–ion trap mass spectrometry (HPLC–ESI–IT–MS) was developed to determine eight typical lipophilic algae toxins (okadaic acid (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1), pectenotoxin-2 (PTX-2), yessotoxin (YTX), azaspiracid1, 2 (AZA1, AZA2), spirolidel1 (SPX1), gymnodimine (GYM)) in marine microalgae powder. The powder was extracted using ultrasound-assisted extraction after the algae cell-breaking process was performed using ultrasonication. The crude extracts were then analyzed using HPLC–ESI–IT–MS in the multiple reaction monitoring mode. The results showed that the calibration curve for each lipophilic algae toxin was obtained with a good correlation coefficient (2>0.991) in its linear concentration. The detection limits of the eight target toxins ranged from 0.85 to 1.315 pg. The average recoveries of these toxins ranged from 88.5% to 111.4% with relative standard deviations in the range of 4.82%–10.17%. The proposed method was applied to determine typical lipophilic algae toxins inmarine microalgae powder, and good results were obtained. The results also indicated that this method is a useful tool for determining lipophilic algae toxins in marine microalgae powder.

High-performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry; Diarrhetic shellfish poisoning; Marine microalgae

(本文編輯: 康亦兼)

Dec. 25, 2015

[Shandong Provincial Natural Science Foundation, No.ZR2015PD003; National Natural Science Foundation of China-Shandong Joint Funded Project, No.U1406403; National Science & Technology Pillar Program of China, No.2013BAK12B00]

Q503 ; O657.7+2

A

1000-3096(2016)10-0113-07

10.11759/hykx20151225002

2015-12-25;

2016-05-16

山東省自然科學基金(ZR2015PD003); 國家基金委-山東省聯合基金項目(U1406403); 國家科技支撐計劃項目(2013BAK12B00)

高莉媛(1991), 女, 山東海陽人, 碩士研究生, 主要從事海洋環(huán)境化學相關研究, E-mail: gaoliyuan316@foxmail.com; 陳軍輝, 通信作者, 博士, 副研究員; 電話: 0532-88966705, E-mail: jhchen@ fio.org.cn