余新建, 張西陽, 林文治, 周蕊蓮, 吳玉萍

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珠江口3種鯨豚的基因多態(tài)性研究

余新建1, 2, 3, 4, 張西陽1, 2, 3, 4, 林文治1, 2, 3, 4, 周蕊蓮1, 2, 3, 4, 吳玉萍1, 2, 3, 4

(1. 南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 廣東珠海 519082; 2. 廣東省海洋資源與近岸工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東珠海 519082; 3. 珠海市海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東珠海 519082; 4. 中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 廣東珠海 519082)

旨在了解珠江口棲息的中華白海豚()、寬脊江豚()和點(diǎn)斑原海豚()免疫相關(guān)基因()的多態(tài)性及其表達(dá)情況, 以期為這3種鯨豚的保育工作提供基礎(chǔ)資料。通過克隆測序的方法, 首次證實(shí)基因在這3種鯨豚體內(nèi)表達(dá)。選擇壓力分析, 表明基因在這3種鯨豚中均受到強(qiáng)烈的正選擇作用, 提示其具有重要的免疫功能。3種鯨豚的基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上相互混雜在一起, 表明基因存在跨物種多態(tài)性。結(jié)合選擇壓力分析和跨物種多態(tài)性, 發(fā)現(xiàn)基因受到平衡選擇作用。珠江口3種鯨豚基因多態(tài)性可能由平衡選擇維持。

鯨豚;(); 表達(dá); 平衡選擇

主要組織相容性復(fù)合體(,)是存在于大部分脊椎動(dòng)物基因組中與免疫功能密切相關(guān)的一個(gè)基因家族?；蛲ㄟ^編碼不同的細(xì)胞表面受體, 識(shí)別并結(jié)合抗原, 并將其遞呈到效應(yīng)細(xì)胞, 從而激發(fā)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)組成、組織表達(dá)類型及進(jìn)化史的差異,基因家族又可分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類3個(gè)亞家族。其中,類分子多表達(dá)在有核細(xì)胞表面, 在對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體(主要是病毒)的免疫防御中扮演著重要角色?；蚴羌棺祫?dòng)物中最具多態(tài)性的功能基因, 其中病原體介導(dǎo)的平衡選擇被認(rèn)為是維持基因家族的等位基因多樣性的主要原因[1]?；蚨鄻有运降慕档蜁?huì)削弱種群對(duì)突發(fā)性傳染性病原體的抵抗力和生存力[2]。因此, 對(duì)野生動(dòng)物尤其是保護(hù)物種的基因多樣性研究已成為近年來的熱點(diǎn)。

目前, 國內(nèi)有關(guān)脊椎動(dòng)物基因的研究比較多, 如應(yīng)用在半滑舌鰨()的輔助育種研究中[3]。哺乳動(dòng)物基因的研究主要集中在陸生動(dòng)物, 如大熊貓()、恒河猴()等[4-5]。然而有關(guān)海洋哺乳動(dòng)物, 如鯨豚類基因的研究則較少。目前中國有關(guān)中華白海豚()、寬脊江豚()、點(diǎn)斑原海豚()類基因的研究涉及多個(gè)水域[6-8]。張西陽等[9]對(duì)珠江口中華白海豚基因的研究發(fā)現(xiàn)其基因多樣性較低, 推測原因可能是該種群歷史上經(jīng)歷了長期的瓶頸效應(yīng)。但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)珠江口水域這3種鯨豚基因研究的報(bào)道。

近年來, 珠江口鯨豚感染病原體的情況時(shí)有報(bào)道。香港的中華白海豚、寬脊江豚和寬吻海豚()中, 64頭鯨豚中有29%的個(gè)體發(fā)現(xiàn)病原體感染的情況[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)2頭中華白海豚受病原體感染[11]。遺傳多樣性降低會(huì)造成中華白海豚對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力下降[12], 可能導(dǎo)致其易感染病原體。病原體具有引起動(dòng)物大規(guī)模死亡的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。因此, 對(duì)瀕危物種的基因多態(tài)性的研究, 對(duì)于探討環(huán)境中的病原體對(duì)該物種的威脅及該物種在抵抗疾病和適應(yīng)環(huán)境變化等方面的能力具有重要意義。

本研究通過對(duì)珠江口水域的中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚的基因進(jìn)行表達(dá)分析和克隆測序, 以探究這3種常見鯨豚的基因是否表達(dá)及基因多態(tài)性, 并通過選擇壓力分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析, 初步探討形成這種基因多態(tài)性特征的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用擱淺死亡于珠江口的中華白海豚、寬脊江豚、點(diǎn)斑原海豚新鮮肌肉樣本。樣本取得后立即保存于Trizol中及–80℃中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

總RNA的提取參照RNAisoTMPlus(TaKaRa), 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測其完整性和濃度, 用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)將提取的RNA用Oligo(dT)引物逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)鏈DNA (Complementary DNA, cDNA)。采用經(jīng)典酚-氯仿法提取基因組DNA(Genomic DNA, gDNA)。

1.3 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物的純化、克隆及測序

使用2對(duì)引物DoLA-F/R和I2F/R分別擴(kuò)增3種鯨豚的基因表達(dá)序列及其外顯子2序列, 產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)?zāi)康钠?。引物信息見?。PCR反應(yīng)體系包含6.88 μL ddH2O, 2×GC buffer I 12.5 μL, dNTP(10 mmol/L)2 μL, BSA(200 m g/L) 1.50 μL, 正、反引物(20 μmol/L)各0.5 μL, LA Taq 0.12 μL, 模板DNA(約100 mg/L) 1.00 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性1 min, 55/50℃退火1 min, 72℃延伸4 min, 共35個(gè)循環(huán); 然后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測后, 用Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒(TaKaRa)純化回收。

表1 MHC-I表達(dá)片段及外顯子2片段的擴(kuò)增所用引物

*: 引文的引物為簡并引物, 本研究根據(jù)表達(dá)序列對(duì)引物有所修改

純化后的DNA連接上pMD-19載體(TaKaRa), 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α 菌株。待平板上長出菌落, 利用藍(lán)白斑篩選的方法挑出至少15個(gè)白色陽性菌落, 送至北京六合華大基因科技股份有限公司廣州測序部進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用BioEdit軟件[17]進(jìn)行序列比對(duì), 以確定變異位點(diǎn)及等位基因。等位基因的命名參照家貓的命名原則: 一個(gè)新的等位基因的確定, 需要在同一個(gè)體的至少兩個(gè)克隆中出現(xiàn), 或者在不同個(gè)體中出現(xiàn)[18]。為了分析物種間基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 使用Modeltest 3.7確定最合適的核酸替代模型[19]; 以家牛()作為外群, 使用MrBayes3.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。使用MEGA6計(jì)算平均核苷酸差異。使用DNAsp軟件和MEGA 6軟件對(duì)基因外顯子2及其肽結(jié)合區(qū)(Peptide Binding Region, PBR)進(jìn)行選擇壓力分析[21-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1基因的表達(dá)和序列變異

本研究從中華白海豚(1例)、寬脊江豚(2例)和點(diǎn)斑原海豚(1例)肌肉組織中均成功提取高質(zhì)量的RNA和DNA。通過使用特異性引物DoLA-F和DoLA-R對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增, 證實(shí)基因在3種鯨豚肌肉組織中的表達(dá)。中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚肌肉組織中分別檢測到5、4和6條cDNA序列(822 bp) (GenBank: KU757454-KU757468),均包含完整的外顯子2(1~271 bp)、外顯子3(272~546 bp)和外顯子4(547~ 822 bp)。所有序列均未檢測到插入、缺失和終止子, 表明所有的序列都來源于基因組中的功能性分子。使用I2F和I2R引物從相同個(gè)體基因組DNA中擴(kuò)增基因外顯子2序列。這些cDNA序列與gDNA序列均完全配對(duì)。

從中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚基因組中分別擴(kuò)增得到6、5和6個(gè)等位基因(147 bp), 變異位點(diǎn)數(shù)分別為32(21.8%)、23(15.6%)和28個(gè)(19.0%), 相應(yīng)的氨基酸序列變異位點(diǎn)數(shù)為18(36.7%)、16(32.7%)和17個(gè)(34.7%), 大部分變異位點(diǎn)集中在基因的功能區(qū), 如PBR區(qū)(表2)。珠江口中華白海豚有4個(gè)等位基因與其他水域中華白海豚一致[8](GenBank: EF375575, EF375576, EF375579, EF375580)。珠江口寬脊江豚中有2個(gè)等位基因與其他水域?qū)捈菇嘁恢?GenBank: DQ843624, DQ843625)[7]。新發(fā)現(xiàn)的基因命名如下: 中華白海豚為(GenBank: KU759499、KU759500); 寬脊江豚為(GenBank: KU759501- KU759503); 點(diǎn)斑原海豚為(GenBank: KU759504- KU759509)。

2.2系統(tǒng)發(fā)育

對(duì)基因核苷酸替代模型進(jìn)行分析后, 采用AIC(Akaike Information Criterion)分析結(jié)果中的TVM+I+G模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。珠江口3種鯨豚與灰鯨()、印度-太平洋瓶鼻海豚()、條紋原海豚()、赫氏海豚()等序列相似度都在90%以上?；姻L作為須鯨, 其基因單獨(dú)聚為1支(Mysticeti)(圖1)。其他齒鯨基因主要聚為5支(Odontoceti Ⅰ~Ⅴ), 但并沒有明顯的種屬聚類趨勢, 不同物種的等位基因分散聚合, 表現(xiàn)出明顯的跨物種多態(tài)性。例如其中1支為寬脊江豚(Ⅳ), 另外4支中均有寬脊江豚基因存在(圖1)。分支Ⅰ中均發(fā)現(xiàn)中華白海豚、寬脊江豚、點(diǎn)斑原海豚和赫氏海豚基因相互交叉(如與分別聚合后形成1支); 分支Ⅱ和Ⅴ中也與此類似(圖1)。

: DQ190936;: EU024810~EU024816;: AF149216;: AF149219;: AF149220;: AF188615;: DG843624;: DG843625;: DQ843630;: DQ843634; Neph-I*17: DQ843640;: DQ843653;: DQ843655;: DQ843656;: EF375575 ~EF375580;: EU698989;: EU698990;: EU698992 ~EU698996

2.3 選擇作用

使用DNAsp軟件對(duì)中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚的基因外顯子2分析Tagima’值, 發(fā)現(xiàn)中華白海豚(0.114 14,>0.10)、寬脊江豚(0.376 64,>0.10)和點(diǎn)斑原海豚(1.06748,>0.10)的值均大于0(表3), 但是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并不顯著, 不能排除無正選擇作用存在的零假設(shè)。而使用MEGA 6.0軟件的檢驗(yàn)對(duì)3種鯨豚的外顯子2及其肽結(jié)合區(qū)(PBR)進(jìn)行選擇壓力分析(表4), 發(fā)現(xiàn)中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚基因外顯子2及其PBR區(qū)的非同義替代率(N)顯著高于同義替代率(S), 均達(dá)到顯著水平(<0.05)甚至極顯著水平(<0.01), 提示正選擇作用的存在[23]。而點(diǎn)斑原海豚基因外顯子2非PBR區(qū)也顯示出較高的值(N/S), 且達(dá)到極顯著水平(<0.01), 提示其整個(gè)外顯子2區(qū)都受到正選擇作用。

表3 珠江口中華白海豚、寬脊江豚、點(diǎn)斑原海豚MHC-I基因的多態(tài)性和選擇作用參數(shù)

: 個(gè)體數(shù)量;R: 等位基因豐度;: 差異的堿基位點(diǎn)數(shù);1:占總堿基數(shù)的比例;A: 差異的氨基酸位點(diǎn)數(shù);2:A占總氨基酸殘基數(shù)的比例;: 平均核苷酸差異;: Tajima檢測統(tǒng)計(jì)值

表4 珠江口3種鯨豚MHC-I基因、PBR區(qū)和非PBR區(qū)非同義替代與同義替代的估計(jì)值

N、S均根據(jù)Nei-Gojobori方法計(jì)算;N: 非同義替代率的估計(jì)值;S: 同義替代率的估計(jì)值;1、2: 1 000次重復(fù)計(jì)算N、S的標(biāo)準(zhǔn)誤差;為N/S;為使用檢驗(yàn)時(shí)接受零假設(shè)的可能性; *:<0.05, 顯著水平; **:<0.01, 極顯著水平

3 討論

3.1 基因表達(dá)

本研究通過從新鮮樣本肌肉中獲取cDNA和gDNA, 擴(kuò)增測序后發(fā)現(xiàn)這些cDNA序列與對(duì)應(yīng)的gDNA外顯子序列完全匹配, 排除假基因的可能性, 確認(rèn)基因在珠江口3種常見鯨豚體內(nèi)表達(dá)。一般來說, 脊椎動(dòng)物均表達(dá)基因。目前, 關(guān)于鯨豚基因表達(dá)的研究還比較少。例如赫氏海豚[24], 在2個(gè)個(gè)體中僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)共同的基因cDNA。有趣的是多種海豚中僅發(fā)現(xiàn)1~2條cDNA[15, 24], 而本研究中3種鯨豚均表達(dá)4條以上基因cDNA。這可能與珠江口生存的海豚接觸病原體機(jī)會(huì)較高有關(guān)[25]。

3.2 基因位點(diǎn)數(shù)及基因變異

本研究的中華白海豚、點(diǎn)斑原海豚每個(gè)個(gè)體含有6個(gè)等位基因, 估計(jì)中華白海豚、點(diǎn)斑原海豚均至少有3個(gè)基因座位。這與Xu等人對(duì)中華白海豚基因座位估計(jì)的數(shù)目一致[8]。目前鯨豚中只有窄脊江豚()基因座位數(shù)被確定為4個(gè), 然而各基因座位序列之間相似度較高[26]。

將珠江口中華白海豚種群與廈門等水域種群相比, 本研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)獨(dú)有的等位基因, 但未發(fā)現(xiàn)廈門等水域共有的1個(gè)等位基因(GenBank: EF375574)[8]。與其他等位基因差異較大。

3.3 平衡選擇

平衡選擇作用于珠江口3種鯨豚基因主要有以下兩方面的依據(jù)[27]。一方面是本研究的中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚的基因外顯子2和PBR區(qū)均檢測到正選擇作用。另一方面是本研究中的3種鯨豚基因存在跨物種多態(tài)性。一般來說平衡選擇趨向于提高種群雜合度和在維持基因較高多樣性中扮演重要角色[28-29]。中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚均檢測到多個(gè)等位基因, 結(jié)果與之吻合。PBR區(qū)具有重要功能是其檢測到強(qiáng)烈平衡選擇作用的原因, 而處于其毗連區(qū)的非PBR區(qū)的突變位點(diǎn)也可能更容易被保留[30]。這可能是導(dǎo)致在點(diǎn)斑原海豚的基因的非PBR區(qū)也檢測到選擇作用的原因。

3.4 跨物種多態(tài)性

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚的基因外顯子2序列并不按照物種分開, 而是與其他的鯨豚混雜在一起, 提示跨物種多態(tài)性的存在?？缥锓N多態(tài)性是指一些相同的或相似的等位基因在不同物種中同時(shí)存在。一般有3種可能的機(jī)制來解釋這個(gè)現(xiàn)象。第一種機(jī)制是親緣關(guān)系較近的物種具有相似的等位基因被認(rèn)為是來自于共同祖先, 這種跨物種等位基因在物種形成之前就存在不同物種世系中[31]。本研究的3種鯨豚都隸屬于齒鯨亞目, 它們親緣關(guān)系較近, 所以跨物種多態(tài)性有可能是共同祖先造成。同樣的機(jī)制也在其他鯨豚中發(fā)現(xiàn)[7]。第二種機(jī)制是趨同進(jìn)化, 生物在應(yīng)對(duì)相同的環(huán)境壓力而產(chǎn)生相同的適應(yīng)性變化[32]。盡管本研究的中華白海豚、寬脊江豚、點(diǎn)斑原海豚均為近岸型鯨豚, 但它們生存環(huán)境的特性并不相同, 因而面臨不同的病原體壓力。然而赫氏海豚、條紋原海豚為遠(yuǎn)洋性齒鯨, 其生存環(huán)境與近岸環(huán)境可能有較大差別。因而趨同進(jìn)化并不適用于解釋其基因跨物種多態(tài)性。第三種機(jī)制是滲透雜交。海豚較其他哺乳動(dòng)物容易產(chǎn)生可育后代[33], 例如寬吻海豚和長吻真海豚()[34]。但通過多年對(duì)珠江口中華白海豚的監(jiān)測, 我們并沒有發(fā)現(xiàn)任何潛在的雜交后代。

綜上所述, 珠江口水域的中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚均生活在具有較大的病原體壓力的近海環(huán)境中,基因的表達(dá)對(duì)于其抵抗病原體感染具有重要作用。珠江口的中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚基因受到病原體介導(dǎo)的平衡選擇作用, 對(duì)于維持基因多態(tài)性具有重要意義。3種鯨豚之間的基因存在跨物種多態(tài)性, 可能來源于它們的共同祖先?？紤]到日益嚴(yán)峻的環(huán)境趨勢[35-36],珠江口水域的中華白海豚、寬脊江豚和點(diǎn)斑原海豚的保育工作仍然任重道遠(yuǎn)。

致謝: 感謝香港海洋公園保育基金(OPCFHK)和廣東珠江口中華白海豚國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局的大力支持。

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Study ofpolymorphism in three cetaceans from the Pearl River Estuary, China

YU Xin-jian1, 2, 3, 4, ZHANG Xi-yang1, 2, 3, 4, LIN Wen-zhi1, 2, 3, 4, ZHOU Rui-lian1, 2, 3, 4, WU Yu-ping1, 2, 3, 4

(1. South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center, Zhuhai 519082, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Resources and Coastal Engineering, Zhuhai 519082, China; 3. Zhuhai Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment, Zhuhai 519082, China; 4. School of Marine Sciences, Sun Yat-Sen University, Zhuhai 519082, China)

To gain the basic knowledge about cetacean conservation, we assessed the polymorphism and expression of the immunologic gene() in three cetaceans (,, and) around the Pearl River Estuary. We first confirmed the expression ofgenes in the three cetaceans by cloning and sequencing. After selection pressure analysis, we found that relatively strong positive selections have acted ongenes in these three cetaceans, suggesting their important immunologic function. Phylogenetic analysis showed that thegenes of the three cetaceans did not cluster to three branches according to species but were mixed up, which implies the existence of trans-species polymorphism (TSP). Together with the results of selection pressure analysis and TSP, we suggest that intense balancing selection has acted ongenes in these three cetaceans, which further maintained the polymorphism ofgenes.

cetaceans;(); expression; balancing selection

(本文編輯: 劉珊珊)

Apr. 24, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.41276147, No.41576128; Chinese White Dolphin Conservation Action Plan of the Ministry of Agriculture, No.2015; Ocean Park Conservation Fund Hong Kong, No.2013]

Q953

A

1000-3096(2016)10-0126-08

10.11759/hykx20160424001

2016-04-24;

2016-08-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41276147, 41576128); 農(nóng)業(yè)部中華白海豚保護(hù)行動(dòng)計(jì)劃(2015); 香港海洋公園保育基金(2013)

余新建(1991-), 男, 江西撫州人, 碩士研究生, 主要從事海洋鯨豚保護(hù)遺傳學(xué)研究, 電話: 15820590518, E-mail: earthclean@ 163.com; 張西陽, 與第一作者同等貢獻(xiàn), 博士研究生, 主要從事海洋鯨豚保護(hù)遺傳學(xué)研究; 吳玉萍, 通信作者, 教授, E-mail: exwyp@ mail.sysu.edu.cn