陳小娟，潘曉潔，鄒怡，萬成炎

（水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點實驗室，水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所，湖北武漢430079）

阿特拉津的在線監(jiān)測預(yù)警方法初探

陳小娟，潘曉潔，鄒怡，萬成炎

（水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點實驗室，水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所，湖北武漢430079）

為探索我國水體阿特拉津污染的在線監(jiān)測預(yù)警方法，利用藻類在線水體監(jiān)測系統(tǒng)（A-TOX）研究了阿特拉津?qū)Φ鞍缀诵∏蛟澹–hlorella pyrenoidosa）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）的光合抑制作用。結(jié)果表明，該系統(tǒng)檢測出低濃度阿特拉津在短時間（0.5 h、1 h、2 h）內(nèi)對3種綠藻光合作用的抑制效應(yīng)隨著阿特拉津濃度的增加而顯著上升；萊茵衣藻對阿特拉津最敏感。在線監(jiān)測預(yù)警我國水體阿特拉津污染時，建議采用萊茵衣藻作為A-TOX的測試藻類；以3 μg·L-1作為阿特拉津污染的預(yù)警濃度值時，作用間隔時間0.5 h、光合抑制率3%可以作為A-TOX預(yù)警設(shè)置的一種參考，但在應(yīng)用時還需根據(jù)監(jiān)測水體實際情況進(jìn)行校正。

阿特拉津；敏感藻類；光合抑制率；在線監(jiān)測預(yù)警

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，水環(huán)境污染問題逐漸受到關(guān)注，水環(huán)境的生物監(jiān)測技術(shù)也得到不斷發(fā)展。傳統(tǒng)生物監(jiān)測主要是通過對生物形態(tài)、生理或發(fā)育與繁殖的變化，以及種群數(shù)量、群落生態(tài)系統(tǒng)等方面的變化進(jìn)行監(jiān)測統(tǒng)計。但是，這往往需要復(fù)雜的人工操作，實驗周期較長，且不能連續(xù)監(jiān)測，因而不能及時反映水體狀況，在水環(huán)境監(jiān)測預(yù)警應(yīng)用中具有一定的局限性。20世紀(jì)80年代后，生物和現(xiàn)代電子科技的發(fā)展使生物信息檢測逐漸數(shù)字化、智能化，進(jìn)而建立了在線水體生物監(jiān)測技術(shù)，通過連續(xù)地檢測不同指示生物的行為或生理方面的變化，實現(xiàn)了對水環(huán)境自動、實時的監(jiān)測和及時預(yù)警。根據(jù)選用的指示生物，應(yīng)用較多的在線生物監(jiān)測系統(tǒng)主要包括以下幾種類型：細(xì)菌在線生物監(jiān)測系統(tǒng)、藻類在線生物監(jiān)測系統(tǒng)、水蚤在線生物監(jiān)測系統(tǒng)、雙殼軟體動物在線生物監(jiān)測系統(tǒng)和魚類在線生物監(jiān)測系統(tǒng)。德國、荷蘭、英國、美國、日本和韓國等已將不同類型的在線水體生物監(jiān)測系統(tǒng)應(yīng)用于河流、水廠等水環(huán)境監(jiān)測預(yù)警。Arnd等[1]將歐洲化學(xué)局化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫中近694種化學(xué)物質(zhì)的生物毒性研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析顯示：相對于魚類、蚤類毒性實驗結(jié)果，藻類生長抑制實驗所獲得的EC50/LC50值最低的只有43.5%[2]。因此，以藻類為指示生物的在線監(jiān)測系統(tǒng)如德國bbe公司生產(chǎn)的bbe algae toximeter（簡稱A-TOX）、DF algae test等通過測試水體對綠藻光合效率的影響以反映水體污染的綜合毒性狀況，成為歐洲河流（如萊茵河、易北河、繆斯河）和飲用水源水體污染監(jiān)測預(yù)警的有力工具[3]。

阿特拉津（Atrazine），又名莠去津，是一種選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型苗前、苗后除草劑，在世界很多國家的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[4]。我國在20世紀(jì)80年代初開始使用阿特拉津，此后平均每年用量增加20%，生產(chǎn)與使用量已居世界前列[5]。但已有研究顯示，阿特拉津具有干擾內(nèi)分泌、影響機(jī)體抗氧化系統(tǒng)、損傷機(jī)體組織器官等方面的生物毒性作用[6、7]。阿特拉津具有較大的極性、水溶性及穩(wěn)定性，通過降雨或農(nóng)田灌溉等多種途徑可從土壤遷移到水體，從而對水生生態(tài)環(huán)境和人類飲用水源構(gòu)成潛在的威脅[8]。在美國、法國、瑞士等許多國家河流、湖泊、水庫等水體中發(fā)現(xiàn)有阿特拉津殘留[9-11]。例如，美國工程兵師團(tuán)堪薩斯管區(qū)水庫阿特拉津污染的監(jiān)測結(jié)果顯示，有10座水庫壩前最高濃度超過了3 μg·L-1，烏龜溪水庫來水阿特拉津最大濃度達(dá)到了41.2 μg·L-1[12]。我國太湖、淮河、遼河、北京官廳水庫、中國香港地區(qū)水庫和河水等地表水體中也有阿特拉津污染的研究報道[13-17]，其中淮河信陽、阜陽、淮南、蚌埠4個監(jiān)測斷面檢測到的阿特拉津最高質(zhì)量濃度甚至達(dá)到81.3 μg·L-1[18]。

由于使用量大、殘留期長、檢出率高和具有干擾內(nèi)分泌等作用，阿特拉津污染受到廣泛的關(guān)注，因而對水體阿特拉津污染進(jìn)行長期、連續(xù)的監(jiān)測十分必要。目前，國內(nèi)有關(guān)生物在線監(jiān)測預(yù)警的應(yīng)用研究較少。如何科學(xué)應(yīng)用在線水體生物監(jiān)測系統(tǒng)，更好地進(jìn)行水體阿特拉津污染的在線監(jiān)測預(yù)警，尚待研究探索。為此，本文利用一種國內(nèi)外應(yīng)用比較廣泛的藻類在線監(jiān)測系統(tǒng)A-TOX開展阿特拉津的在線監(jiān)測預(yù)警方法的初步探索研究，選擇綠藻中應(yīng)用廣泛的蛋白核小球藻、斜生柵藻、萊茵衣藻作為系統(tǒng)的測試藻類，通過研究比較阿特拉津?qū)?種不同藻類光合作用的影響來篩選敏感測試藻類，進(jìn)而摸索阿特拉津在線監(jiān)測預(yù)警系統(tǒng)的設(shè)置。

1 材料與方法

1.1 測試藻種及培養(yǎng)基

選取蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa，F(xiàn)ACHB9#）、斜生柵藻（Scenedesmusobliquus，F(xiàn)ACHB416#）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，F(xiàn)ACHB 479#）作為測試藻類。藻種來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。采用SE培養(yǎng)基，在溫度25℃、光照4 000 Lx條件下通氣培養(yǎng)。

1.2 測試農(nóng)藥

阿特拉津，純度99.9%，購自美國百靈威（Accustandard.Inc）。用丙酮助溶，蒸餾水配制母液備用。分別加不同量的阿特拉津母液至2 L蒸餾水中配制為2.5、5、10、20、40 μg·L-1的溶液，供試驗備用。

1.3 在線監(jiān)測系統(tǒng)測試

分別以蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）、萊茵衣藻（C.reinhardtii）、斜生柵藻（S.obliquus）作為測試生物，采用藻類在線水體監(jiān)測系統(tǒng)A-TOX研究阿特拉津?qū)?種藻類的光合作用的抑制效應(yīng)。

該在線水體監(jiān)測系統(tǒng)的基本構(gòu)造和測試原理詳見李明等[19]的文獻(xiàn)。藻類光合活性的計算公式為

式（1）中：Genty為藻類光合活性；F0為沒有背景光時的熒光反應(yīng)；Fm為有強(qiáng)背景光時的熒光反應(yīng)。光合抑制率為樣品水與參比水中藻類光合活性之差，計算公式為

將對數(shù)期藻細(xì)胞懸液接種至A-TOX的培養(yǎng)罐中，溫度設(shè)置為25℃，藻細(xì)胞濃度設(shè)置為2 000 μg·L-1。當(dāng)A-TOX培養(yǎng)罐中藻細(xì)胞濃度達(dá)到設(shè)定值時，開始測試。

A-TOX在線監(jiān)測阿特拉津的作用間隔時間分別設(shè)置為0.5 h、1 h、2 h，其監(jiān)測總時間分別達(dá)3 h、6 h和12 h以上。系統(tǒng)采用蒸餾水為參比水，以10 μg·L-1的敵草隆溶液為標(biāo)準(zhǔn)毒物。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用A-TOX自動記錄的光合抑制率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；赑robit模型對阿特拉津濃度、藻類光合效率抑制率進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出不同反應(yīng)間隔時間下阿特拉津?qū)?種藻類光合影響的EC50值。利用Statistic軟件對不同實驗組間的差異進(jìn)行多因素方差分析（顯著差異水平為P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 阿特拉津?qū)Φ鞍缀诵∏蛟澹–.pyrenoidosa）的光合抑制作用

不同作用時間、不同濃度阿特拉津?qū)Φ鞍缀诵∏蛟骞夂献饔玫囊种坡室妶D1。2.5 μg·L-1阿特拉津作用0.5 h、1 h未對蛋白核小球藻光合作用產(chǎn)生抑制作用，作用時間延長到2 h時產(chǎn)生了輕微的抑制（平均抑制率為2.33%）；隨著濃度的增加，阿特拉津?qū)Φ鞍缀诵∏蛟骞夂献饔玫囊种坡手饾u增大。除2.5、10 μg·L-1濃度外，其他濃度組的蛋白核小球藻呈現(xiàn)出作用0.5 h時抑制率最高的現(xiàn)象。

圖1 阿特拉津?qū)Φ鞍缀诵∏蛟宓墓夂弦种谱饔肍ig.1 Photosynthetic inhibition rate of Atrazine on C.pyrenoidosa

2.2 阿特拉津?qū)θR茵衣藻（C.reinhardtii）的光合抑制作用

不同作用時間、不同濃度阿特拉津?qū)θR茵衣藻光合抑制率如圖2。當(dāng)濃度為2.5 μg·L-1，阿特拉津在短時間（0.5 h）就對萊茵衣藻光合作用產(chǎn)生了抑制作用，平均抑制率達(dá)到2.59%，但光合抑制率并未隨作用時間的延長而顯著提高。隨著濃度的增加，阿特拉津?qū)θR茵衣藻光合作用抑制率顯著提高。但同一濃度組中，抑制率并未隨作用時間延長而顯著增加，總體上作用1 h時的光合抑制率較作用0.5 h和2 h時低。

圖2 阿特拉津?qū)θR茵衣藻的光合抑制作用Fig.2 Photosynthetic inhibition rate of Atrazine on C.reinhardtii

2.3 阿特拉津?qū)π鄙鷸旁澹⊿.obliquus）的光合抑制作用

不同作用時間、不同濃度阿特拉津?qū)π鄙鷸旁骞夂弦种坡嗜鐖D3所示。當(dāng)濃度為2.5 μg·L-1，阿特拉津未對斜生柵藻光合作用產(chǎn)生抑制作用。作用時間為2 h時，光合抑制率總體隨著濃度增加顯著增大；作用時間為0.5 h時，阿特拉津?qū)π鄙鷸旁骞夂献饔靡种坡试诟鳚舛冉M總體無顯著差異，除濃度為40 μg·L-1外，作用時間為1 h的各濃度組間也無顯著差異。同一濃度組，總體上作用2 h時的光合抑制率顯著高于作用0.5 h、1 h試驗組，但作用0.5 h和2 h試驗組間的光合抑制率差異不顯著。

圖3 阿特拉津?qū)π鄙鷸旁宓墓夂弦种谱饔肍ig.3 Photosynthetic inhibition rate of Atrazine on S.obliquus

3 討論

徐小花等在研究阿特拉津?qū)︺~綠微囊藻和四尾柵藻生長的影響時發(fā)現(xiàn)，在0.001～5 mg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，阿特拉津?qū)︺~綠微囊藻和四尾柵藻的生長表現(xiàn)出低濃度刺激、高濃度抑制的效應(yīng)，且阿特拉津?qū)λ奈矕旁宓拇碳ば?yīng)明顯大于銅綠微囊藻[20]。也有研究顯示，在0.01 mg·L-1阿特拉津處理下，綠藻和藍(lán)藻生長被抑制，硅藻生長卻增加[21]。本文分別以3種綠藻為測試生物，利用在線毒性監(jiān)測系統(tǒng)檢測到了低濃度阿特拉津（2.5～40 μg·L-1）在短時間（0.5 h、1 h、2 h）作用下對3種藻類光合作用的抑制作用，但未出現(xiàn)促進(jìn)作用。生長促進(jìn)作用可能與低濃度、較長時間脅迫下一些藻類光合作用的適應(yīng)性有關(guān)[22]。阿特拉津能夠通過抑制藻類光合作用基因的表達(dá)，降低光合作用色素葉綠素a和藻膽蛋白的合成，切斷電子傳遞鏈等影響光合作用[23、24]。因此，通過在線監(jiān)測系統(tǒng)短時間內(nèi)檢測綠藻光合抑制率可以及時監(jiān)測預(yù)警水體阿特拉津污染。

不同藻類對阿特拉津的敏感度有差異，敏感藻類往往因毒性評價方法不同而改變。Tang[22]等分別研究了阿特拉津作用7 d、14 d、21 d、28 d時對4種綠藻和4種硅藻生長和光合作用的影響，100 μg·L-1阿特拉津能顯著抑制綠藻生長，而對硅藻生長的顯著抑制作用則在250 μg·L-1處理下才顯現(xiàn)，綠藻總體上比硅藻更為敏感；阿特拉津處理7天對4種綠藻Chlamydomonas sp.、Chlorella sp.、Pediastrum sp.、Scenedesmus quadricauda的葉綠素a含量影響的EC50分別為46.5、72.9、536.6、171 μg·L-1。吳穎慧等研究阿特拉津?qū)?種藻類的96 h生長抑制效應(yīng)表明，生長抑制效應(yīng)由強(qiáng)到弱分別為斜生柵藻、柱孢魚腥藻、萊哈衣藻、菱形藻、普通小球藻、羊角月牙藻和鐮形纖維藻，其中普通小球藻、羊角月牙藻的96 h-EC50分別約為0.06 mg·L-1、0.09 mg·L-1[25]。Ma等研究了40種除草劑對羊角月牙藻（Raphidocelis subcapitata）、普通小球藻（Chlorella vulgaris）的96 h急性毒性效應(yīng)，獲得阿特拉津EC50分別為0.11 mg·L-1、0.43 mg·L-1[26、27]。本文利用A-TOX研究阿特拉津?qū)?種藻類的光合抑制作用結(jié)果表明，在短時間（0.5 h）低濃度（2.5 μg·L-1）阿特拉津處理下，萊茵衣藻光合作用受到輕微影響，抑制率為2.6%，但未檢測到對小球藻、柵藻的光合抑制作用；10 μg·L-1阿特拉津已經(jīng)能夠顯著抑制萊茵衣藻的光合作用（平均抑制率為9.52%），而對小球藻光合作用的顯著抑制在濃度達(dá)到20 μg·L-1時才顯現(xiàn)（平均抑制率為6.71%），柵藻光合作用即使在40 μg·L-1處理下也不顯著（平均抑制率為4.84%）。基于Probit模型對阿特拉津濃度、藻類光合作用抑制率進(jìn)行統(tǒng)計分析得出，不同作用時間下，阿特拉津?qū)?種藻類光合抑制作用的EC50值見表1。從表1結(jié)果可以看出，萊茵衣藻對阿特拉津最為敏感，其次是蛋白核小球藻，最后是斜生柵藻。因此，在線水體監(jiān)測系統(tǒng)（A-TOX）對阿特拉津污染的測試生物應(yīng)采用萊茵衣藻。

表1 基于光合抑制率的阿特拉津?qū)?種藻類毒性作用的EC50值Table 1 The EC50of toxicity of Atrazine to three species of algae based on the photosynthetic inhibition rate

目前，美國、歐共體和我國均把阿特拉津列入內(nèi)分泌干擾劑化合物名單。根據(jù)《中華人民共和國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB 3838-2002）》，集中式生活飲用水地表水源地阿特拉津的濃度限值為3.0 μg·L-1。3.0 μg·L-1阿特拉津脅迫下，不同作用時間對萊茵衣藻產(chǎn)生的光合抑制率見圖4。圖中結(jié)果顯示，作用時間為0.5 h時，光合抑制率變動范圍為2.37%～3.64%。作用間隔時間為0.5 h和1 h時，光合抑制率約為3%±0.5%和3.2%±1.5%，無顯著性差異；作用間隔時間為2 h時，光合抑制率顯著增加到6.7%±1.6%。因此，利用A-TOX進(jìn)行水體阿特拉津污染在線監(jiān)測預(yù)警時，可采用萊茵衣藻為測試生物，系統(tǒng)預(yù)警參數(shù)可設(shè)置為：作用間隔時間為0.5 h、報警值為3%光合抑制率。

圖43 .0 μg·L-1阿特拉津在不同作用時間下對萊茵衣藻的光合抑制作用Fig.4 Photosynthetic inhibition rate of 3.0 μg·L-1Atrazine to C.reinhard under the diffirent time

作用間隔時間0.5 h時，阿特拉津濃度與萊茵衣藻光合作用抑制率間的相關(guān)關(guān)系見圖5。由于水環(huán)境中污染物往往是多來源、多種類的復(fù)合污染，它們之間可能存在拮抗、相加和協(xié)同作用；同時，由于每種生物的特性不同，其反應(yīng)敏感的污染物也會有所不同。本文結(jié)果可為水體污染在線監(jiān)測提供一種參考，但在應(yīng)用時還需根據(jù)監(jiān)測水體實際情況進(jìn)行校正。

圖5 作用時間0.5 h時阿特拉津濃度與萊茵衣藻光合抑制率間的相關(guān)關(guān)系Fig.5 The relationship between photosynthetic inhibition rate of C.reinhardtii and the concentration of Atrazine during 0.5 h

為全面地監(jiān)測水體環(huán)境，做好水體各種污染在線監(jiān)測與預(yù)警工作，可借鑒發(fā)達(dá)國家有關(guān)水體在線監(jiān)測預(yù)警的先進(jìn)技術(shù)、方法和運行管理經(jīng)驗，采取細(xì)菌、藻類、魚類等多種在線生物監(jiān)測系統(tǒng)同時進(jìn)行監(jiān)測，或者在水樣前處理時設(shè)置水樣自動濃縮裝置，從而提高水體在線監(jiān)測預(yù)警的敏感性[3]。在生物在線監(jiān)測的同時，開展水體理化環(huán)境的在線監(jiān)測與分析。當(dāng)生物在線監(jiān)測發(fā)出報警時，水體理化在線監(jiān)測能及時提供水體污染物種類及其濃度的變化等方面的重要信息，可為管理部門制定相應(yīng)應(yīng)急處理措施提供全面的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

利用藻類在線水體監(jiān)測系統(tǒng)（A-TOX）能檢測出低濃度阿特拉津（2.5～40 μg·L-1）在短時間（0.5 h、1 h、2 h）作用時對3種綠藻的光合抑制作用；隨著濃度的增加，阿特拉津?qū)?種藻類的光合抑制率顯著上升。萊茵衣藻對阿特拉津最敏感，可以作為A-TOX的測試藻類進(jìn)行水體阿特拉津污染的在線監(jiān)測預(yù)警。以3 μg·L-1作為阿特拉津污染的預(yù)警濃度值時，作用間隔時間0.5 h、光合抑制率3%可以作為藻類在線水體監(jiān)測系統(tǒng)預(yù)警設(shè)置的一種參考，但在應(yīng)用時還需根據(jù)監(jiān)測水體實際情況進(jìn)行校正。

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[責(zé)任編輯：和諧]

Study on the Online Monitoring and Early Warning Method for Atrazine

CHEN Xiao-juan,PAN Xiao-jie,ZOU Yi,WAN Cheng-yan

（Key Laboratory of Ecological Impacts of Hydraulic-projects and Restoration of Aquatic Ecosystem of Ministry of Water Resources, Institute of Hydroecology,Ministry of Water Resources and Chinese Academy of Sciences,Hubei Wuhan 430079,China）

In order to study the online monitoring and early warning method for atrazine pollution in water, the toxic effects of atrazine on three green algae species（Chlorella pyrenoidosa,Chlamydomonas reinhardtiiandScenedesmus obliquus）were respectively studied by using one kind of online algae water monitoring system (A-TOX).The results showed that the A-TOX could detect the acute toxicity effects of the low concentration atrazine on the green algae within 0.5 h,1 h and 2 h,respectively.With the increase of the atrazine concentration, photosynthetic inhibition rates of algae increased significantly.It was also found thatChlamydomonas reinhardtiiwas the most sensitive to atrazine.For the online detection of atrazine pollution in Chinese water environment,C.reinhardtiican be used as a test organism of A-TOX.And when a monitoring and early warning of atrazine contaminated concentration limit value is 3 μg·L-1,the early warning parameter values for A-TOX could be that inhibition rate is 3%and detecting time range is 0.5 h,but they also need to be corrected according to the monitored water environment.

Atrazine;sensitive algae;photosynthetic inhibition rate;online monitoring and early warning

X830.2

A

096-2347（2016）03-0001-07

10.19478/j.cnki.2096-2347.2016.03.01

2016-07-22

國家自然科學(xué)基金項目（51579159）；水利部“948”項目（200902）。

陳小娟（1981—），女，河南許昌人，博士，研究員，主要從事水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測評價研究。E-mail：chenxiaojuan@mail.ihe.ac.cn