羅 娜 丁志麗 張易祥 孔有琴 吳成龍 姜志強 葉金云*

(1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命科學學院，大連116000；2.浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學院，湖州313000)

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飼料亞麻酸含量對日本沼蝦生長、抗氧化能力、非特異性免疫性能及抗氨氮脅迫能力的影響

羅 娜1,2丁志麗2張易祥2孔有琴2吳成龍2姜志強1葉金云2*

(1.大連海洋大學水產(chǎn)與生命科學學院，大連116000；2.浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學院，湖州313000)

亞麻酸(C18∶3n-3，LNA)作為一種重要的多不飽和脂肪酸，對甲殼動物生長、免疫保護和抵抗環(huán)境脅迫具有重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗旨在研究飼料LNA含量對日本沼蝦生長、抗氧化能力、非特異性免疫性能和抗氨氮脅迫能力的影響，探討日本沼蝦飼料中適宜的LNA含量。試驗配制LNA含量分別為0(L0，對照)、0.5%(L0.5)、1.0%(L1.0)、1.5%(L1.5)、2.0%(L2.0)和2.5%(L2.5)的6種等氮等脂的半純化飼料，飼喂初始體重為(0.12±0.01) g日本沼蝦幼蝦8周。每種飼料投喂5個水族箱(重復)，每個水族箱放養(yǎng)50尾試驗魚。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從每個水族箱選取10尾試驗魚進行24 h氨氮(水體總氨氮濃度為36.6 mg/L)脅迫試驗。結(jié)果表明：日本沼蝦特定生長率、增重率和存活率均隨飼料LNA含量的增加呈先升后降的趨勢，但組間差異不顯著(P>0.05)。LNA的含量在肝胰腺和肌肉中都隨飼料LNA含量的增加而增加。隨著飼料中LNA含量的增加，日本沼蝦肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力和總抗氧化能力(T-AOC)基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且均在L1.0組達到最高值。L0.5、L1.0、L1.5、L2.0和L2.5組肝胰腺丙二醛(MDA)含量顯著低于L0組(P<0.05)。肝胰腺堿性磷酸酶(ACP)活力以L1.0組最高，但L1.0和L1.5組之間不存在顯著性差異(P>0.05)。隨著飼料LNA含量的增加，肝胰腺溶菌酶(LYZ)活力呈先升后降的趨勢，在L1.5組達到最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。24 h氨氮脅迫后，L0.5、L1.5、L2.0、L2.5組的肝胰腺MDA含量顯著低于L0組(P<0.05)，且以L1.5組MDA含量最低，顯著低于其余各組(P<0.05)；肝胰腺SOD活力和T-AOC隨著飼料LNA含量的增加呈先上升后下降趨勢，L1.5組SOD活力達到最高，L1.0組T-AOC達到最高；肝胰腺GSH-Px活力以L0組最高，但與L1.0組差異不顯著(P>0.05)。以肝胰腺SOD活力為指標，經(jīng)二次回歸分析得出日本沼蝦的LNA需要量為1.19%。綜上，飼料中適宜的LNA含量(1.0%～1.5%)能改善日本沼蝦的生長，增強其抗氧化能力和非特異性免疫性能，緩解氨氮脅迫對其造成的負面影響。

日本沼蝦；亞麻酸；生長；抗氧化；非特異性免疫；抗氨氮脅迫

脂肪酸在水生生物免疫和炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。在對魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)具有免疫調(diào)控作用，包括增強吞噬作用、呼吸爆發(fā)活動、抗原呈遞及體液免疫過程[3-5]。亞麻酸(C18∶3n-3，LNA)，屬于十八碳PUFA，是合成類二十烷酸(包括前列腺素和白細胞三烯)的前體，并能通過增強免疫功能激活前列腺素以及提高抗氧化應激能力[6]。如Wu等[7]對石斑魚(Epinephelusmalabaricus)的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中LNA與亞油酸(C18∶2n-6，LOA)的比率為3.3(亞麻籽油含量為28.8%，LOA含量為1.3%)時，頭腎白細胞吞噬作用和呼吸爆發(fā)活動顯著增強。另有研究發(fā)現(xiàn)，用亞麻油(亞麻油組飼料中LNA含量為48.1%)完全替代魚油(魚油組飼料中LNA含量為3.3%)并不影響歐亞鱸(Percafluviatilis)機體非特異免疫性能和抗病原脅迫能力[2]。

一般認為，甲殼動物將十八碳PUFA轉(zhuǎn)化為高不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFA)的能力有限，不足以滿足其生長發(fā)育的需要，所以飼料中必須對其予以補充。不同物種對LNA和LOA的需求量存在差異，據(jù)NRC(2011)的資料顯示，蝦類對LNA的需求量要高于其對LOA的需求量[8]。研究者以生長性能為主要評價指標，已確立了中國對蝦(Penaeuschinensis)[9]、褐對蝦(Penaeusaztecus)[10]和印度對蝦(Penaeusindicus)[11]對LNA的需求量。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)隸屬于節(jié)肢動物門，甲殼綱，十足目，長臂蝦科，沼蝦屬，是一種廣泛分布于偏堿和淡水水域中的蝦類，因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富而備受人們的喜愛，成為我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中主要的經(jīng)濟蝦種之一[12]。據(jù)統(tǒng)計，近10年來，我國日本沼蝦的養(yǎng)殖業(yè)一直保持相當穩(wěn)定的產(chǎn)量[13-14]，但日本沼蝦抗應激能力比較弱，在高密度養(yǎng)殖模式下容易出現(xiàn)應激反應，嚴重制約了日本沼蝦的養(yǎng)殖效益和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。養(yǎng)殖過程中蝦類應激反應和疾病的暴發(fā)與蝦類自身免疫機能密切相關[15]。研究表明飼料中脂肪酸含量會影響動物的免疫力[16]。如在對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中花生四烯酸(C20∶4n-6,ARA)含量影響其免疫相關基因——Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、免疫缺陷(immune deficiency,IMD)和溶菌酶(lysozyme，LYZ)的表達，且ARA調(diào)控免疫相關基因表達的效果受飼料二十碳五烯酸(C20∶5n-3,EPA)和二十二碳六烯酸(C22∶6n-3,DHA)含量的影響[17]。而關于飼料不飽和脂肪酸含量對日本沼蝦抗氧化能力和免疫酶活性的影響尚未見報道。因此，本研究通過在飼料中添加LNA，探討飼喂日本沼蝦不同LNA含量飼料后，其生長性能、肝胰腺抗氧化酶和免疫酶活性的變化情況，以及在氨氮脅迫下抗氧化指標的變化情況，旨在確定日本沼蝦飼料中LNA的適宜含量，并為對蝦抵抗外界環(huán)境應激研究提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

秘魯白魚粉(粗蛋白質(zhì)含量為66.69%，粗脂肪含量為9.10%)由浙江璟寶飼料股份有限公司提供。亞麻籽油由萊瑙(上海)國際貿(mào)易有限公司提供，LNA含量為50%。以魚粉和酪蛋白為蛋白質(zhì)源，配制等氮等脂的LNA含量分別為0(L0，對照)、0.5%(L0.5)、1.0%(L1.0)、1.5%(L1.5)、2.0%(L2.0)和2.5%(L2.5)的半純化飼料。試驗飼料的制作步驟如下：首先將各種原料粉碎過80目篩，按配方準確稱量，采用逐級擴大法將維生素、礦物質(zhì)預混料和誘食劑等微量成分按比例充分混勻，然后加入亞麻籽油、大豆卵磷脂繼續(xù)搓勻，最后加入水(400 mL/kg)攪拌混勻，用小型飼料造粒機制成粒徑為1.0 mm的顆粒飼料，40 ℃烘干至飼料中水分含量達到約10%，密封后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1，試驗飼料脂肪酸組成見表2。

1.2 試驗蝦及其飼養(yǎng)管理

試驗用蝦購于湖州邦達生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，暫養(yǎng)1周后，選擇健康、體重均勻[(平均體重為(0.12±0.01) g]的日本沼蝦1 500尾，隨機分為6組，每組5個重復，每個重復50尾，以重復為單位隨機放入到體積為300 L的水族箱中，每個水族箱內(nèi)放置一定量的網(wǎng)片作為躲避物，以減少試驗蝦互殘。試驗于2015年7月至2015年9月在浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室進行，每天07:30吸污并換水(換水量約為1/3)，試驗使用的水源為曝氣的自來水，水質(zhì)條件為：溫度25～29 ℃，pH 7.6～8.1，溶氧濃度>6.5 mg/L，總氨氮濃度<0.01 mg/L。每日于08:30和16:00各投喂1次飼料，投喂量為蝦體重的4%～5%，養(yǎng)殖試驗持續(xù)8周。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)誘食劑為每千克飼料提供Attractant provided the following per kg of diets：甘氨酸 glycine 60 mg，丙氨酸 alanine 60 mg，谷氨酸 glutamic acid 60 mg，甜菜堿 betain 120 mg。

2)每千克維生素預混料含有Contained the following per kg of vitamin premix：VA 4 200 000 IU，VC 60 g，VE 20 g，VD31 200 000 IU，VK 10 g，VB110 g，VB210 g，VB616 g，VB1220 mg，煙酸 nicotinic acid 50 g，葉酸 folic acid 4 g，肌醇 inositol 60 g，生物素 biotin 100 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 35 g。

3)每千克礦物質(zhì)預混料含有Contained the following per kg of mineral premix：KCl 28 g，MgSO4·7H2O 100 g，NaH2PO4215 g，KH2PO4100 g，Ca(H2PO4)2·H2O 265 g，CaCO3105 g，C6H10CaO6·5H2O 165 g，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 12 g，ZnSO4·7H2O 4.76 g，MnSO4·H2O 1.07 g，AlCl3·6H2O 0.15 g，CuCl2·2H2O 0.24 g，CoCl2·6H2O 1.4 g，KI 0.23 g，α-纖維素 α-cellulose 2.15 g。

4)總能根據(jù)蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的能量系數(shù)(分別為23.6、39.5和17.2 kJ/g)來計算。Gross energy was calculated based on the energy coefficients for protein, lipid and carbohydrate (23.6, 39.5 and 17.2 kJ/g, respectively).

表2 試驗飼料脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比)

續(xù)表2脂肪酸Fattyacids試驗飼料ExperimentaldietsL0L0.5L1.0L1.5L2.0L2.5C16∶1n-70.780.780.800.820.720.82C18∶1n-70.030.100.050.110.040.09C18∶1n-94.397.2911.0212.0914.5717.29ΣMUFA5.208.1711.8713.0215.3318.20C18∶2n-62.064.097.097.979.8112.04C20∶2n-60.080.120.110.120.100.12Σn-6PUFA2.144.217.208.099.9112.16C18∶3n-30.077.9817.5023.2329.9837.45C20∶5n-31.161.191.291.141.141.27C22∶6n-32.822.843.012.572.412.82Σn-3PUFA4.0512.0121.8026.9433.5341.54LNA/LOA0.031.952.472.913.063.11

表中只顯示了主要的脂肪酸，實測脂肪酸包括：C12∶0、C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0、C21∶0、C22∶0、C14∶1、C16∶1n-7、C17∶1、C18∶1n-9、 C20∶1n-9、C22∶1n-9、C24∶1n-9、C20∶2、C22∶2、C18∶2n-6、C18∶3n-3、C18∶3n-6、C20∶4n-6、C20∶5n-3、C22∶5n-3和C22∶6n-3。SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸；LNA：亞麻酸；LOA亞油酸。表4和表5同。

Only the major fatty acids were shown in the table, and the detected fatty acids included: C12∶0, C14∶0, C15∶0, C16∶0, C17∶0, C18∶0, C14∶1, 16∶1n-7, C17∶1, C18∶1n-9, C20∶1n-9, C22∶1n-9, C24∶1n-9, C20∶2, C22∶2, C18∶2n-6, C18∶3n-3, C18∶3n-6, C20∶4n-6, C20∶5n-3, C22∶5n-3 and C22∶6n-3. SFA: saturated fatty acids; MUFA: monounsaturated fatty acids; PUFA: polyunsaturated fatty acids; LNA: linolenic acid; LOA: linoleic acid. The same as Table 4 and Table 5.

1.3 氨氮脅迫試驗

8周的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每箱隨機撈取10尾試驗蝦，參照Wang等[18]的方法，用氯化銨調(diào)節(jié)水體總氨氮濃度至36.6 mg/L，進入24 h氨氮脅迫試驗。氨氮脅迫試驗期間連續(xù)充氣，保證溶氧濃度≥5.0 mg/L，pH為7.6～8.1，溫度為25～29 ℃。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后饑餓1 d后，對各組試驗蝦稱重，并統(tǒng)計存活數(shù)。各養(yǎng)殖試驗各組及氨氮脅迫試驗各組試驗蝦，均使用解剖器從試驗蝦的頭胸部取出肝胰腺，將蝦體和肝胰腺保存于-80 ℃用于后續(xù)指標的測定分析。

1.5 指標測定

1.5.1 生長性能指標計算公式

成活率(survival rate,SR,%)=100×
試驗結(jié)束時存活蝦的個體數(shù)/
試驗開始時投放蝦的個體數(shù)；
增重率(weight gain rate,WGR,%) =100×
(終末體重-初始體重)/初始體重；
特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=
100×(ln終末體重-ln初始體重)/試驗天數(shù)；
飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=
飼料攝入量/(終末均重-初始均重)；
攝食率(feeding rate，F(xiàn)R，%)=100×
投餌總量/[試驗天數(shù)×(終末均重+
初始均重)/2]。

1.5.2 常規(guī)指標測定

飼料中粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法(Kjeltec 2200,FOSS,丹麥)，粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法(SoxtecTM2043,FOSS,丹麥)，粗灰分含量的測定采用馬福爐550 ℃灼燒(14 h)法。采用Folch等[19]的方法測定日本沼蝦肝胰腺脂肪含量。

1.5.3 脂肪酸組成測定

根據(jù)常國亮等[20]的方法進行樣品脂肪酸組成分析。所用儀器為HP-6890氣相色譜儀，毛細管柱型號為Agilent 19091J-413(30.0 mm×0.25 mm)。進樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度為260 ℃，起始柱溫為140 ℃，逐步升高到240 ℃，直到所有組分全部出峰，采用面積百分比法對各脂肪酸成分進行定量。

1.5.4 肝胰腺抗氧化指標測定

準確稱取肝胰腺約0.5 g，按質(zhì)量體積比1∶9加入預冷的0.86%的生理鹽水，制成10%的勻漿液，3 500 r/min離心15 min，吸取上清液。根據(jù)各種指標的測定方法將上清液稀釋成不同濃度，其中上清液中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法。所有指標的測定均按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))說明書進行。脂質(zhì)過氧化程度通過測定肝胰腺中丙二醛(MDA)含量變化來反映，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定肝胰腺中MDA含量。脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物中的MDA與TBA縮合形成紅色產(chǎn)物，根據(jù)顏色變化于532 nm處進行比色；超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定采用黃嘌呤氧化酶法，活力單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個活力單位(U)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的測定原理為GSH-Px可以促進過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應生成水(H2O)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，通過測定GSH的消耗量進而得出GSH-Px的活力；總抗氧化能力(T-AOC)的測定原理為抗氧化物質(zhì)能使三價鐵離子(Fe3+)還原為二價鐵離子(Fe2+)，后者可與啡啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定絡合物，通過比色測定其抗氧化能力的高低，活力單位定義為37 ℃時每分鐘每毫克組織蛋白質(zhì)使反應體系的吸光度值每增加0.01時為1個T-AOC單位(U)。

1.5.5 肝胰腺非特異性免疫指標的測定

肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LYZ)活力的測定均按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))說明書進行。ACP的測定原理為ACP能分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測定ACP活力的高低。LYZ活力的測定原理是LYZ能水解細菌細胞壁上肽聚糖使細菌裂解而使?jié)舛冉档?，透光度增強，通過透光度變化來推測LYZ的活力。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one way ANOVA)后，若差異達到顯著水平，則采用Tukey’s法進行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 飼料LNA含量對日本沼蝦生長性能的影響

由表3可知，日本沼蝦的增重率和特定生長率隨飼料LNA含量的增加有先升高后下降的趨勢，增重率和特定生長率均以L1.5組最高，但各組間未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。各組日本沼蝦的存活率差異不顯著(P>0.05)。飼料LNA含量對日本沼蝦飼料系數(shù)以及攝食率的影響不顯著(P>0.05)。

表3 各組日本沼蝦的生長性能

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。表6和表7同。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 6 and Table 7.

2.2 飼料LNA含量對日本沼蝦肝胰腺脂肪含量的影響

由圖1可知，日本沼蝦肝胰腺脂肪含量隨飼料LNA含量的增加先升高后下降，在L2.5組達到最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，但L0、L0.5、L1.0及L1.5組間不存在顯著性差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

Date columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2.

圖1 飼料LNA含量對日本沼蝦肝胰腺脂肪含量的影響

Fig.1 Effects of dietary LNA content on hepatopancreas lipid content of oriental river prawn (Macrobrachiumnipponense)

2.3 飼料LNA含量對日本沼蝦肝胰腺和肌肉脂肪酸組成的影響

由表4和表5可知，在肝胰腺和肌肉中，含量最多的是飽和脂肪酸，其次是單不飽和脂肪酸。在肝胰腺中，L0.5組的飽和脂肪酸含量顯著高于除L0組外的其余各組(P<0.05)，而L0組的單不飽和脂肪酸含量顯著高于其余各組(P<0.05)。在肌肉中，L1.0組的飽和脂肪酸含量顯著高于其余各組(P<0.05)，而L0組的單不飽和脂肪酸含量顯著高于其余各組(P<0.05)。C18∶3n-3(即LNA)的含量在肝胰腺和肌肉中都隨飼料LNA含量的增加而增加。而C20∶5n-3(即EPA)和C22∶6n-3(即DHA)含量在肝胰腺和肌肉中都隨飼料LNA含量的增加呈先升后降趨勢。

2.4 飼料LNA含量對日本沼蝦肝胰腺抗氧化指標的影響

由表6可知，隨著飼料LNA含量的增加，日本沼蝦肝胰腺SOD、GSH-Px活力和T-AOC基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢，并均在L1.0組達到最高，其中SOD活力顯著高于其余各組(P<0.05)，GSH-Px活力顯著高于除L0組外的其余各組(P<0.05)，T-AOC顯著高于L1.5、L2.0、L2.5組(P<0.05)。L0組肝胰腺MDA含量最高，顯著高于L0.5、L1.0、L1.5、L2.0、L2.5組(P<0.05)。在1.5%～2.5%范圍內(nèi)，隨著飼料LNA含量的增加，日本沼蝦肝胰腺MDA含量有一定的遞增趨勢。

2.5 飼料LNA含量對日本沼蝦肝胰腺非特異性免疫指標的影響

由圖2可知，L0.5、L1.0及L1.5組肝胰腺ACP活力均顯著高于L0組(P<0.05)，且以L1.0組的活力最高，但L1.0和L1.5組之間不存在顯著性差異(P>0.05)。隨著飼料LNA含量的增加，肝胰腺LYZ活力呈先升后降的趨勢，在L1.5組達到最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4 各組日本沼蝦的肝胰腺脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比)

續(xù)表4脂肪酸Fattyacids組別GroupsL0L0.5L1.0L1.5L2.0L2.5C20∶1n-90.66±0.01d0.04±0.01a0.27±0.04c0.02±0.01a0.10±0.01b0.03±0.01aΣMUFA56.54±0.52e48.21±1.31d46.55±0.65cd42.80±0.64b44.03±2.48bc36.54±0.04aC18∶2n-60.16±0.01a2.02±2.65a5.28±0.12b6.04±0.06bc6.73±0.27bc8.31±0.05cC20∶4n-60.34±0.01b0.38±0.01c0.28±0.01a0.28±0.03a0.34±0.01b0.36±0.01bcΣn-6PUFA0.50±0.01a2.40±2.63a5.56±0.13b6.31±0.04bc7.08±0.27bc8.67±0.06cC18∶3n-30.53±0.01a4.93±0.13b7.66±0.08c11.66±0.05d12.86±0.35e17.32±0.08fC20∶5n-31.30±0.04c1.41±0.05d1.07±0.04a1.18±0.01b1.11±0.02ab1.19±0.05bC22∶5n-30.18±0.01e0.15±0.01d0.10±0.02b0.13±0.01c0.07±0.01a0.07±0.01aC22∶6n-32.06±0.06d2.03±0.09d1.41±0.06b1.75±0.02c1.13±0.01a1.34±0.07bΣn-3PUFA4.07±0.11a8.52±0.27b10.24±0.20c14.71±0.78d15.16±0.38d19.91±0.20e

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。表5同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5.

表5 各組日本沼蝦的肌肉脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比)

表6 各組日本沼蝦的肝胰腺抗氧化指標

續(xù)表6組別Groups丙二醛MDA/(nmol/mgprot)超氧化物歧化酶T-SOD/(U/mgprot)谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px/(U/mgprot)總抗氧化能力T-AOC(U/mgprot)L1.53.25±1.57ab6.15±0.02a2.62±1.30a0.38±0.14aL2.03.81±2.23b7.27±2.10a1.62±0.59a0.53±0.13abL2.54.33±0.10bc4.99±0.59a4.05±0.66a0.55±0.14ab

圖2 飼料LNA含量對日本沼蝦肝胰腺ACP和LYZ活力的影響

2.6 飼料LNA含量對日本沼蝦抗氨氮脅迫能力的影響

由表7可知，24 h氨氮脅迫后，L0.5、L1.5、L2.0、L2.5組的肝胰腺MDA含量顯著低于L0組(P<0.05)，且以L1.5組MDA含量最低，顯著低于其余各組(P<0.05)。肝胰腺SOD活力和T-AOC隨著飼料LNA含量的增加呈先上升后下降趨勢，L1.5組SOD活力達到最高，顯著高于其余各組(P<0.05)，而L1.0組T-AOC達到最高，顯著高于其余各組(P<0.05)。肝胰腺GSH-Px活力以L0組最高，但與L1.0組差異不顯著(P>0.05)。

依據(jù)表7的試驗結(jié)果，以肝胰腺SOD活力(y)為縱坐標，飼料LNA含量(x)為橫坐標得到二者之間的一元二次回歸方程：y=-0.402 1x2+0.953 9x+0.512 5，R2=0.718 4(圖3)，經(jīng)計算，飼料中LNA的最適含量為1.19%。

表7 氨氮脅迫后各組日本沼蝦的肝胰腺抗氧化指標

圖3 日本沼蝦肝胰腺SOD活力與飼料LNA含量的回歸關系

3 討 論

3.1 飼料LNA含量對日本沼蝦生長性能的影響

研究表明，飼料中添加一定量的LNA可促進魚類生長，但攝食過量的LNA對生長不僅無促進作用，反而有抑制作用[1]。與這一結(jié)果相似，本試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)飼料中LNA含量為0～1.5%時，日本沼蝦的特定生長率和增重率呈升高趨勢，但當LNA含量超過1.5%時，其特定生長和增重率有下降趨勢。類似的研究結(jié)果也在魚類中發(fā)現(xiàn)，如草魚(Ctenopharyngodonidellus)攝食含0～0.25% n-3 HUFA飼料時生長性能隨飼料n-3 HUFA含量的增加而上升，但當飼料n-3 HUFA含量達到0.83%或1.13%時，其生長性能顯著下降[21]。此外，對草魚進行為期3個月的n-3 HUFA飼喂后，進行肝胰臟的轉(zhuǎn)錄組學分析，發(fā)現(xiàn)n-3 HUFA能夠影響36個注釋蛋白質(zhì)代謝相關基因的表達，上調(diào)了包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白質(zhì)消化基因，RNA、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動序列和真核翻譯起始因子(eIF-4A)等蛋白質(zhì)翻譯基因的表達，下調(diào)了泛素蛋白連接酶及泛素等蛋白質(zhì)分解基因的表達[22]，說明飼料中PUFA可能通過節(jié)約蛋白質(zhì)的機制促進生長。

通過二次回歸分析發(fā)現(xiàn)，日本沼蝦獲得最大肝胰腺SOD活力時，LNA的需求量為1.19%，高于中國對蝦(0.7%～1.0%)[9]和日本對蝦(Penaeusjaponicas)(1.0%)[23]，但低于印度對蝦(2.0%)[11]對LNA的需求量。這可能是不同蝦類對LNA的代謝率不同，從而導致對LNA需求量存在差異。此外，蝦類對LNA的需求量還與飼料的組成、試驗蝦類規(guī)格、投喂次數(shù)及試驗條件等多種因素有關。

已有研究顯示，飼料中添加LNA可降低機體脂肪含量[24]。與該研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)日本沼蝦肝胰腺脂肪含量隨飼料LNA含量的增加而下降。這與瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)機體脂肪含量隨飼料LNA含量的增加而下降的研究結(jié)果一致[25]，但與在草魚[21]上的研究結(jié)果相反，在草魚上的研究得出，隨著飼料n-3 PUFA含量的增加，草魚機體脂肪含量也隨之增加[21]。這可能與草魚對脂肪的需求量比較低有關。

機體脂肪酸組成基本上與飼料脂肪酸組成是一致的[25-26]。在鮑魚(HaliotisdiscushannaiIno)的研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂高含量LNA的飼料后，其肌肉LNA含量也隨之升高[27]。與該研究結(jié)果一致，本試驗結(jié)果也顯示，隨著飼料LNA含量的增加，日本沼蝦肝胰腺和肌肉中LNA含量也隨之增加。此外，日本沼蝦肝胰腺和肌肉中EPA和DHA含量隨著飼料LNA含量的增加呈先升后降的趨勢，這可能與適宜的LNA含量可增強脂肪酸去飽和酶和延長酶的活力，從而促進十八碳PUFA轉(zhuǎn)化成HUPA有關[27-28]。

3.2 飼料LNA含量對日本沼蝦抗氧化能力、非特異性免疫性能的影響

已有研究表明，瓦氏黃顙魚肝胰腺非特異性免疫酶活力隨飼料LNA含量的增加而增強，然而，當LNA含量超過1%時，其非特異性免疫酶活力顯著下調(diào)[29]。與該結(jié)果一致，本試驗結(jié)果顯示，日本沼蝦肝胰腺SOD、GSH-Px活力和T-AOC隨飼料LNA含量的增加基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且均在L1.0組達到最高，說明過量的LNA誘發(fā)了脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)的過氧化能產(chǎn)生眾多有毒的活性氧簇(ROS)，如超氧陰離子自由基(O2-·)、H2O2和臭氧等。為了清除過多的ROS，SOD將ROS催化為H2O2，從而緩解ROS對機體的損傷[30-32]。在本研究中，日本沼蝦肝胰腺SOD活力隨飼料LNA含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，L1.0組顯著高于其余各組，但在L0、L0.5、L1.5、L2.0和L2.5組之間并不存在顯著性差異。這說明飼料中添加1.0%LNA可增強肝胰腺SOD活力，但PUFA過氧化產(chǎn)物超過該臨界值時不能增強SOD活力。T-AOC是機體內(nèi)抗氧化能力的總體體現(xiàn)，是酶促[SOD、CAT、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)等]和非酶促(維生素、氨基酸和金屬蛋白等)兩方面因子抗氧化能力的總和。本試驗結(jié)果顯示，當飼料中LNA含量達到1.0%時，肝胰腺T-AOC達到最大值。與本試驗結(jié)果相似，潘瑜等[33]也發(fā)現(xiàn)，亞麻油替代25%魚油時鯉魚(Cyprinuscarpio)肝胰臟T-AOC達到最大值。這說明飼料中適宜的LNA含量可以提高機體的抗氧化能力。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的PUFA引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用形成的產(chǎn)物，MDA含量的多少常?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，即細胞受損程度。本試驗結(jié)果顯示，L0組肝胰腺MDA含量顯著高于其余各組，說明飼料中缺乏LNA可引起一定程度的細胞受損，這可能與機體缺乏必需脂肪酸有關[34]。但是，在1.5%～2.5%范圍內(nèi)，隨著飼料LNA含量的增加，日本沼蝦肝胰腺MDA含量有一定的遞增趨勢。這與在褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)中發(fā)現(xiàn)的高含量的n-3 HUFA引起機體積累MDA的結(jié)果[35]相似。綜上所述，以肝胰腺抗氧化能力為判據(jù)，認為飼料中LAN的適宜含量為1.0%。

研究還發(fā)現(xiàn)，適度的HUFA供應可強化淡水魚類的免疫力，而過量則有可能造成負面影響[36-37]。因此，本試驗測定了肝胰腺中非特異性免疫指標ACP和LYZ活力。ACP能參與對外源生物大分子的降解[38]，而且是巨噬細胞溶酶體的水解酶，其活力的提高能增加巨噬細胞清除病原的能力[39]。而LYZ是非特異性免疫反應的媒介，能抵制寄生蟲、細菌與病毒的感染[17,40]。本試驗結(jié)果顯示L1.0組肝胰腺ACP活力顯著高于其他各組，而從LYZ活力來看，L1.5組顯著高于其余各組。關于n-3 PUFA對機體免疫系統(tǒng)的影響在魚類中報道較多，各研究結(jié)果不盡相同。楊鳶劼等[41]研究發(fā)現(xiàn)，黃鱔(Monopterusalbus)血清LYZ活力和血細胞吞噬能力隨飼料LNA含量的增加而增強，并在LNA含量達到1.55%時達到最高。Li等[5]在瓦氏黃顙魚的研究中發(fā)現(xiàn)，6%亞麻油組的抗體效價顯著高于4%和2%亞麻油組。以上結(jié)果說明飼料中適宜含量的LNA對機體免疫力有一定的促進作用。

3.3 飼料LNA含量對日本沼蝦抗氨氮脅迫能力的影響

經(jīng)過24 h的氨氮脅迫后，L0組的肝胰腺MDA含量均高于其余各組，同時其肝胰腺SOD活力和T-AOC均低于其余各組。這可能與L0組缺乏LNA有關。本試驗結(jié)果顯示，氨氮脅迫后肝胰腺SOD活力和T-AOC均隨飼料LNA含量的增加呈先升后降的趨勢。趙亞婷等[42]對中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的研究發(fā)現(xiàn)，在低氧脅迫下，飼料中添加適量的DHA顯著提高了幼蟹血淋巴中SOD活力，并且降低了MDA含量，與本試驗結(jié)果類似；但飼料中過量的DHA使血淋巴中MDA含量顯著升高，這可能是由于過量的DHA氧化產(chǎn)生了較多的MDA，機體產(chǎn)生的SOD等抗氧化酶難以對其有效保護。但Ji等[21]對草魚幼魚的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中高含量的HUFA能顯著提高草魚幼魚的肝胰腺SOD活力和MDA含量，說明過量的HUFA能誘發(fā)魚體的氧化應激，在對奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[43]。由此提示，在適宜的脂肪酸含量范圍內(nèi)，隨著飼料中PUFA含量的提高，機體的抗氧化性能也隨之升高。本試驗結(jié)果顯示，經(jīng)過24 h的氨氮脅迫后，飼料LNA含量為1.5%時，肝胰腺MAD含量最低，SOD活力和T-AOC最高，由此表明，1.5%LNA能增強機體抗氧化能力，從而改善日本沼蝦對氨氮脅迫的應激反應能力。

4 結(jié) 論

① 綜合考慮飼料LNA含量對生長、抗氧化能力、非特異性免疫性能及抗氨氮脅迫能力的影響，認為日本沼蝦飼料中亞麻酸的適宜含量為1.0%～1.5%。

② 本試驗條件下，通過二次回歸分析，認為飼料LNA含量為1.19%時，日本沼蝦可獲得最高的肝胰腺SOD活力。

致謝：

衷心感謝李景芬、張榮飛、邵仙萍、趙建華等老師以及嚴超、費嘉誠等同學在試驗和論文撰寫過程中提供的熱心幫助。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yjy@zjhu.edu.cn

(責任編輯 菅景穎)

Effects of Dietary Linolenic Acid Content on Growth, Antioxidant Capacity, Non-Specific Immunity and Anti-Ammonia-Nitrite Stress Ability of Oriental River Prawn (Macrobrachium nipponense)

LUO Na1,2DING Zhili2ZHANG Yixiang2KONG Youqin2WU Chenglong2JIANG Zhiqiang1YE Jinyun2*

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116000,China; 2.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticResourcesConservationandDevelopment,KeyLaboratoryofAquaticAnimalGeneticBreedingandNutritionofChineseAcademyofFisherySciences,CollegeofLifeScience,HuzhouUniversity,Huzhou313000,China)

Linolenic acid (C18∶3n-3, LNA) is one of the important polyunsaturated fatty acids (PUFA) for the regulation of growth, immunity and environmental stress resistance of crustacean. This experiment was investigated to study the effects of dietary LNA content on growth, antioxidant capacity, non-specific immunity and anti-ammonia-nitrite stress ability of oriental river prawn (Macrobrachiumnipponense), and to discuss the suitable dietary LNA content. LNA was added to the diets to formulate six isonitrogenous and isolipidic semipurified diets containing 0 (L0, control), 0.5% (L0.5), 1.0% (L1.0), 1.5% (L1.5), 2.0% (L2.0) and 2.5% (L2.5) LNA, respectively. Each diets fed 5 tanks (replicates) with 50 prawns per tank. After 8 weeks of feeding, ten prawns from each tank were exposed to ammonia nitrogen (total ammonia nitrogen concentration in water was 36.6 mg/L) for 24 h. The results showed as follows: with the dietary LNA content increasing, the specific growth rate, weight gain rate and survival rate of prawns were increased firstly and then decreased, but the differences were not significant among all groups (P>0.05). The contents of LNA in hepatopancreas and muscle were all increased with the dietary LNA content increasing. The superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px) activities and total antioxidant capacity (T-AOC) in hepatopancreas basically showed a trend of first increasing and then decreasing with the dietary LNA content increasing, and all of them reached the highest values in L1.0 group. The hepatopancreas malondialdehyde (MDA) content in L0.5, L1.0, L1.5, L2.0 and L2.5 groups was significantly lower than that in L0 group (P<0.05). The prawn fed the diet with 1.0% LNA showed the highest hepatopancreas acid phosphatase (ACP), however, there was no significant difference between L1.0 and L1.5 groups (P>0.05). Hepatopancreas lysozyme (LYZ) activity increased at first and then decreased with the dietary LNA content increasing, and it reached the highest activity in L1.5 group which was significantly higher than that in other groups (P<0.05). After 24 h ammonia-nitrite stress, hepatopancreas MDA content in L0.5, L1.5, L2.0 and L2.5 groups was significantly lower than that in L0 group (P<0.05), and the L1.5 group had the lowest MDA content which was significantly lower than that in other groups (P<0.05); hepatopancreas SOD activity and T-AOC showed a trend of first increasing and then decreasing with the dietary LNA content increasing, and them reached the highest values in L1.5 and L1.0 groups, respectively; hepatopancreas GSH-Px activity reached the highest value in L0 group, however, there was no significant difference between L0 and L1.0 groups (P>0.05). Taking hepatopancreas SOD activity as the indicator, the requirement of LNA for oriental river prawn was 1.19% according to quadratic regression analysis. As a consequence of the above, the suitable dietary LNA content (1.0% to 1.5%) can improve the growth, antioxidant capacity, non-specific immunity, and can relax the negative effect caused by anti-ammonia-nitrite stress of oriental river prawn.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(1)：134-146]

oriental river prawn (Macrobrachiumnipponense); linolenic acid; growth; antioxidant; non-specific immune; anti-ammonia-nitrite stress

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.01.016

2016-07-18

浙江省重大科技專項計劃項目(2014C02011)；浙江省自然科學基金(LQ14C190004)；國家自然科學基金(31402308)；浙江省重點研發(fā)計劃項目(2015C03018)

羅 娜(1991—)，女，廣西河池人，碩士研究生，從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail: lndkylw@outlook.com

*通信作者：葉金云，研究員，博士生導師，E-mail: yjy@zjhu.edu.cn

S963

A

1006-267X(2017)01-0134-13