夏金玲 沈陽市康平縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 （遼寧 沈陽 110500）

Microflex MALDI-TOF MS全自動微生物分析系統(tǒng)對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定能力評估

夏金玲 沈陽市康平縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 （遼寧 沈陽 110500）

目的：分析Microflex?MALDI-TOF MS全自動微生物分析系統(tǒng)對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定能力。方法：選擇500株腸桿菌科質(zhì)控菌株與臨床分離菌株作為檢測標(biāo)本，分別進(jìn)行Microflex?MALDI-TOF MS與Vitek 2 Compact菌株鑒定，對兩組方案的檢測結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。結(jié)果：Microfex?MALDI-TOF MS對細(xì)菌種、屬的鑒定率分別為97.00%（485/500）與3.00%（15/500），Vitek 2 Compact對細(xì)胞種、群、屬的鑒定率分別為83.20%（416/500）、14.20%（71/500）、2.60%（13/500），比較兩組方式的鑒定符合率差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論：對腸桿菌科細(xì)胞采取Microfex?MALDI-TOF MS鑒定方式的符合率明顯高于Vitek 2 Compact鑒定方式，具有成本低、操作簡便、快速等優(yōu)勢，建議在醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

全自動微生物分析系統(tǒng) 微生物檢測 腸桿菌科細(xì)菌

近些年來，革蘭陰性桿菌在臨床微生物的樣本中分離率已經(jīng)超過70%[1]，其中33%左右為腸桿菌科細(xì)菌[2]，該類細(xì)菌與人類之間的關(guān)系密切。近些年來，隨著臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)、免疫抑制劑等的快速發(fā)展，導(dǎo)致醫(yī)院感染事件的發(fā)生率與日俱增（腸桿菌科細(xì)胞導(dǎo)致），因此，對感染性疾病積極進(jìn)行臨床診斷與治療的意義重大。本次研究對腸桿菌科細(xì)菌采取Microfex?MALDI-TOF MS全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定方式，可達(dá)到較為顯著的應(yīng)用效果。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇500株腸桿菌科質(zhì)控菌株與臨床分離菌株作為檢測標(biāo)本，所有檢測標(biāo)本均由本地臨床檢驗(yàn)中心2015年1月～2015年12月各類樣本分離得來。

1.2 方法

選擇實(shí)驗(yàn)儀器與試劑類型包括：Vitek 2 Compact與配套的革蘭陰性桿菌鑒定卡、Microflex?MALDI-TOF MS檢測儀與α-氰基-4-羥基肉桂酸、Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler聚合酶鏈反應(yīng)、ABI Prism 310 CeneticAnalyzer DNA測序儀、PCR擴(kuò)增試劑盒與DNA膠回收試劑盒、Test Standard（BTS）、三氟乙酸、乙醇、甲酸、沙門菌屬診斷血清等。

Vitek 2 Compact鑒定：嚴(yán)格挑選純菌落（平板上），準(zhǔn)備好菌懸液（濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬o予Vitek 2 Compact與配套的鑒定板完成操作。

MALDI-TOF MS儀的鑒定：切換為線性操作工作模式，選擇基質(zhì)抑制偏轉(zhuǎn)模式。提取脈沖離子（100ns），2000～20000為相對分子質(zhì)量。選擇待測樣本，將去離子水與乙醇加入，含量分別為300μL與μL，充分將其混勻后離心操作，之后進(jìn)行干燥沉淀處理，將1～80μL的甲酸水溶液（70%）兌入，并搖勻，之后加入等量的乙腈，并混勻，連續(xù)離心2min之后選取1μL的上清液，滴入MALDI靶板內(nèi)并晾干（室溫狀態(tài)下），將α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液（含量為1μL）對上述樣本點(diǎn)嚴(yán)格進(jìn)行覆蓋，并在室溫下晾干處理。之后進(jìn)行質(zhì)譜分析，將上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)納入數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行處理，若檢測得知評分≥1.7則說明檢測的樣本圖譜與數(shù)據(jù)庫中相匹配的圖譜高度具有一定的相似性。

血清凝集：嚴(yán)格依照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）中對沙門菌血清凝集試驗(yàn)中的操作方案進(jìn)行。

測序基因：提取細(xì)菌基因組的DNA（選用水煮法），檢測模板為細(xì)菌基因組DNA，之后采取PCR擴(kuò)增處理，采取細(xì)菌16S核糖體進(jìn)行操作，嚴(yán)格依照試劑說明書上的內(nèi)容進(jìn)行PCR體系配置。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳處理后，將DNA條帶瓊脂凝膠塊進(jìn)行割取，并采用DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，之后測序DNA序列，將檢測得知的DNA序列與BLAST工具比較，由此獲取菌株類別。

1.3 評價(jià)指標(biāo)

對比兩組鑒定方法的符合率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采取SPSS18.0的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件納入本文檢測所需數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果用率表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

Microflex?MALDI-TOF MS對細(xì)菌種、屬的鑒定率分別為97.00%（485/500） 與3.00%（15/500），Vitek 2 Compact對細(xì)胞種、群、屬的鑒定率分別為83.20%（416/500）、14.20%（71/500）、2.60%（13/500），比較兩組方式的鑒定符合率差異顯著（P＜0.05）。

3.討論

腸桿菌科細(xì)菌在臨床上稱之為一類感染病原菌[3]，分布范圍十分廣泛，較為多見，可引發(fā)肺炎、傷口感染、血流感染等不良情況，受到醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。以往臨床上對腸桿菌科細(xì)菌主要采取手工板條法與儀器法進(jìn)行鑒定，其中儀器法中最常見的為Vitek 2 Compact，均是依據(jù)細(xì)菌生化反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行判定的，存在較高的成本且檢測時(shí)間較長，Microflex?MALDI-TOF MS技術(shù)屬于一類近些年來新興的對微生物進(jìn)行檢測的方案，已經(jīng)在微生物領(lǐng)域中得到了廣泛的推廣。

本次研究對500株腸桿菌科細(xì)菌分別采取Microflex?MALDI-TOF MS與Vitek 2 Compact進(jìn)行菌株鑒定，并對于結(jié)果不符的菌株采取沙門菌血清凝集試驗(yàn)再次進(jìn)行確認(rèn)，并對兩種不同的檢測方式鑒定符合率進(jìn)行比較可知，其差異具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中Vitek 2 Compact數(shù)據(jù)庫中由于陰溝腸桿菌等屬于復(fù)合群，普通變形桿菌與潘氏變形桿菌屬于同一個(gè)復(fù)合群，將往往使得上述細(xì)菌鑒定程度只能到群，在數(shù)據(jù)庫等因素的影響下，容易導(dǎo)致分散的泛菌鑒定程度只能到群，分散的泛菌鑒定程度往往只能到屬。

Microflex?MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫中的腸桿菌科細(xì)菌參考圖譜與Vitek 2 Compact相比，前者圖譜種類往往更多，導(dǎo)致前者對于上述細(xì)菌可鑒定至種，對沙門菌株進(jìn)行鑒定時(shí)，采取前者鑒定方式對于腸炎沙門菌、豬霍亂沙門菌可鑒定至種，而后者可對傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌鑒定至種，而采取Vitek 2 Compact檢測技術(shù)對大腸埃希菌進(jìn)行鑒定可知，少量的菌屬未能夠進(jìn)行有效的鑒定，可能是由于菌落黏膜感較強(qiáng)，對較為均勻的菌懸液準(zhǔn)備存在一定的難度，從而直接對鑒定結(jié)果造成一定的影響[4]。

綜上情況可知，對腸桿菌科細(xì)胞采取Microflex?MALDI-TOF MS鑒定方式的符合率明顯高于Vitek 2 Compact鑒定方式，具有成本低、操作簡便、快速等優(yōu)勢，建議在醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

[1] 馮旭慧,袁春兒,陳捷,等.耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的臨床分布及耐藥性[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2016,28(3):312-315.

[2] 劉萍,閆雪苗,張堅(jiān)磊,等.23株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因分析[J].山東醫(yī)藥,2016,56(24):91-93.

[3] 李軍,鄒明祥,王海晨,等.耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2016,26(21):4801-4804.

[4] 魏雪,黃紅兵,劉韜,等.結(jié)直腸腫瘤患者手術(shù)分離易感菌株的藥物敏感性分析[J].中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析,2014,14(2):139-141.

1006-6586(2017)12-0035-02

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2017-03-15