吳蓉 周瑋 何慧園

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210000）

高效液相色譜法測(cè)定固體飲料中Y-氨基丁酸含量

吳蓉*周瑋 何慧園

（江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210000）

Y-氨基丁酸（Y-aminobutyric acid，GABA），又名氨酪酸或哌啶酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，在自然界中的分布極為廣泛，在動(dòng)植物及微生物中均有存在。GABA對(duì)哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，能參與多種代謝活動(dòng)，具有重要的生理功能。GABA在人體內(nèi)作為神經(jīng)傳導(dǎo)的主要介質(zhì)，具有促進(jìn)血管擴(kuò)張降血壓、促進(jìn)睡眠增強(qiáng)記憶力、鎮(zhèn)靜神經(jīng)抗焦慮、預(yù)防及治療癲癇病、加強(qiáng)腦代謝預(yù)防老年癡呆癥等作用。在上世紀(jì)80年代，日本利用植物富集法首次研發(fā)了GABA茶功能性食品。隨后，富含GABA的發(fā)芽糙米實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。目前，GABA已被廣泛地應(yīng)用于飲料、果醬、糕點(diǎn)、餅干、調(diào)味品等食品中，開發(fā)出各種適合不同人群及年齡段的產(chǎn)品，具有極其廣闊的發(fā)展前景。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GABA的測(cè)定方法主要有比色法、氨基酸分析儀法、薄層掃描法、放射性受體法、高效液相色譜法等。由于GABA對(duì)電化學(xué)、紫外、可見光及熒光的響應(yīng)強(qiáng)度低，直接測(cè)定非常困難，需要將其衍生化處理后再測(cè)定，因此，柱前衍生-高效液相色譜法已成為測(cè)定GABA的主要方法。近年來(lái)，常用的GABA衍生化方法主要有法丹磺酰氯（DNS）法、2,4-二硝基氟苯（FDNB）法、6-氨基喹琳基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）法、鄰苯二甲醛（OAP）法。由于FDNB毒性太強(qiáng)、靈敏度低，AQC價(jià)格昂貴，OAP反應(yīng)不穩(wěn)定且數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，因此采用DNS作為GABA測(cè)定的衍生化試劑。與傳統(tǒng)的DNS法相比，本試驗(yàn)優(yōu)化了DNG的使用濃度，節(jié)約了成本，提高了回收率。本文旨在以DNS為衍生化試劑，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定固體飲料中GABA含量的高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固體飲料，南京市生產(chǎn)廠家。

硼酸，分析純，南京化學(xué)試劑一廠；丹磺酰氯，純度≥98%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；冰乙酸，優(yōu)級(jí)純，南京化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉，分析純，蘇彤化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司；甲醇，色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司；水，超純水；Y-氨基丁酸，純度≥99%，SIGMA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；2996二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；XS 205DU電子分析天平，美國(guó)梅特勒-托利多儀器公司；XW-80A混合渦旋儀，上海青浦瀘西儀器廠；SB25-12DTDN超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）GABA，用超純水溶解并定容至10 mL，經(jīng)超聲波溶解后，振蕩混勻，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用超純水按上述步驟將10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.05 g～0.50 g粉碎試樣（精確至0.000 1 g），用純水溶解并定容至100 mL，經(jīng)超聲波溶解后，振蕩混勻，用孔徑0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液，作為衍生化樣品溶液，備用。

1.3.3 硼酸緩沖溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2.47 g硼酸（精確至0.000 1 g），加純水80 mL超聲溶解，用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至10.2，并用水定容至100 mL，配制成0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液。

1.3.4 DNS衍生液的制備

準(zhǔn)確稱取15mgDNS，用乙腈溶解并定容至10mL，經(jīng)超聲波溶解后，振蕩混勻，配制成1.5 mg/mL的DNS溶液。避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 柱前衍生化反應(yīng)

準(zhǔn)確吸取1.3.2中的樣品溶液50μL，加入150μL 0.4 mol/L硼酸緩沖溶液和300 μL 1.5 mg/mL的DNS衍生液，渦旋混勻，靜置反應(yīng)2 min后，過(guò)孔徑0.22 μm濾膜，進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)溶液同步衍生化，步驟同上，標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后的質(zhì)量濃度分別為0.002 5 mg/mL、0.005 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL。

1.3.6 高效液相色譜分析條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 μm× 150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為25 mmol/L的乙酸鈉溶液，用2%的醋酸調(diào)pH值至6.0±0.2；流動(dòng)相B為乙腈；等度洗脫，其中A∶B=68∶32；流速1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

HPLC色譜圖采用Waters Empower工作站采集，使用Empower 2 Software軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.0進(jìn)行繪圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇及優(yōu)化

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，GABA的測(cè)定可以采用乙酸鈉-乙腈或磷酸緩沖溶液-甲醇為流動(dòng)相，但其方法均采用梯度洗脫程序，不僅基線不穩(wěn)而且洗脫時(shí)間長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用等度洗脫，以25 mmol/L的乙酸鈉溶液（pH=6.0）-乙腈為流動(dòng)相，該方法準(zhǔn)確度高，且基線噪音小，能達(dá)到有效地分離效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙酸鈉溶液與乙腈的體積比調(diào)至68∶32，可以在15 min內(nèi)有效地分離GABA，GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示，保留時(shí)間為6.4 min，分離效果良好。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

為了提高方法的靈敏度，選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)至關(guān)重要。本試驗(yàn)采用0.1 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.5進(jìn)行衍生化反應(yīng)，與沒(méi)有添加GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白液做對(duì)比，結(jié)果見圖2。經(jīng)光譜分析后，GABA有3個(gè)最大吸收波長(zhǎng)。同一濃度不同波長(zhǎng)下的GABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖3所示，由響應(yīng)強(qiáng)度分析可得，取GABA衍生物的最大吸收波長(zhǎng)216 nm為最適檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 GABA的定性分析

在1.3.6的色譜條件下，采用1.3.5的方法，對(duì)沒(méi)有添加GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白液、樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)，色譜圖見圖4。由圖4可知，GABA的保留時(shí)間為6.4 min，基線平穩(wěn)，分離效果好，雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)物的測(cè)定無(wú)干擾。

圖2 GABA衍生物的紫外光譜圖

圖4 空白衍生液（A）、標(biāo)準(zhǔn)品（B）和樣品（C）的色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的繪制

將質(zhì)量濃度分別為0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.5進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在1.3.6的色譜條件下測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，衍生后標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X（mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為Y=6.741 1×106X-7 970.3，回歸系數(shù)R2=0.999 5。結(jié)果表明，GABA的質(zhì)量濃度在0.002 5 mg/mL～0.1 mg/mL之間時(shí)，利用本試驗(yàn)方法測(cè)定的結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限為2.514 ng，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程

2.5 精密度試驗(yàn)

對(duì)同一種固體飲料進(jìn)行平行試驗(yàn)共6次，計(jì)算樣品中GABA的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，GABA衍生物峰面積的RSD為0.89%，GABA質(zhì)量濃度的RSD為0.89%。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn)

分別稱取同一質(zhì)量濃度的固體飲料樣品3份，按照樣品溶液中GABA質(zhì)量濃度的80%、100%、120%進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，按照1.3.6的色譜條件及1.3.5的試驗(yàn)方法，測(cè)定樣品中GABA的質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表2所示。由表2可知，本試驗(yàn)方法的回收率在96.00%～102.39%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.80%～2.87%之間。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

GABA在自然界中分布廣泛，但在不同物質(zhì)中的含量差別較大。本試驗(yàn)采用柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定固體飲料中GABA的含量，在傳統(tǒng)的DNS法基礎(chǔ)上，采用等度洗脫，實(shí)現(xiàn)樣品與衍生化試劑的快速分離；選擇最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)，提高靈敏度；優(yōu)化DNS的濃度，提高回收率。OAP作為一種廣譜的衍生化試劑，近年來(lái)被廣泛采用，但其穩(wěn)定性較差，因此，本方法采用DNS作衍生化試劑，不僅能達(dá)到OAP的效果，而且能彌補(bǔ)其存在的不足。同時(shí)與FDNB法及AQC法相比較，該方法成本低、衍生化過(guò)程簡(jiǎn)單、檢測(cè)線性范圍廣、精密度高且重現(xiàn)性好。采用本方法測(cè)定固體飲料中的GABA，回收率范圍在96.00%～102.39%之間，為后續(xù)食品中GABA的測(cè)定提供了有力的平臺(tái)，也為GABA的測(cè)定奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。

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HPLC analysis of Y-am ino butyric acid in solid beverages

WURong*ZHOUWei HE Huiyuan
（Jiangsu province product quality supervision and inspection institute，Jiangsu Nanjing210000，China）

建立了一種快速準(zhǔn)確地測(cè)定固體飲料中Y-氨基丁酸含量的高效液相色譜分析方法：采用丹磺酰氯（Dansyl-Cl）為柱前衍生化試劑，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為25 mmol/L乙酸鈉（pH=6.0）和乙腈的混合溶液（體積比為68∶32），流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，等度洗脫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm。結(jié)果表明，該方法的線性范圍為0.002 5 mg/mL～0.1 mg/mL，R2=0.999 5，線性關(guān)系良好，檢出限2.514 ng，平行試驗(yàn)6次，Y-氨基丁酸質(zhì)量濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.89%，3個(gè)不同濃度的加標(biāo)回收率在96.00%～102.39%之間，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.80%～2.87%之間。與傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法相比，該方法具有基線穩(wěn)定，靈敏度高，線性范圍廣，回收率高及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

固體飲料；Y-氨基丁酸；高效液相色譜；丹磺酰氯

A fast and accurate high performance chromatography method was developed for the determination of Y-aminobutyric acid(GABA)in the solid beverages,by precolumn derivatization with dansyl chloride(Dansyl-Cl).The samples were separated on a Agilent Eclipse XDB-C18at 30℃using 25 mmol/L sodium acetate:acetonitrile(pH=6.0) =68:32 as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min,isocratic elution,inspected by ultraviolet detector at 216 nm.The results showed that the Y-aminobutyric acid(GABA)has a good linear relationship at 0.002 5 mg/mL～0.1 mg/mL,the peak area with correlation coefficient at 0.999 5,and the detection limit was 2.514 ng.The relative standard deviation (RSD)of the mass concentration ofsix times was 0.89%for Y-aminobutyric acid(GABA).The three different concentrations of recoverywas 96.00%～102.39%,and the relative standard deviation(RSD)was 0.80%～2.87%.Compared with the traditional experimental methods,utilizing isocratic elution,optimizing the detection wavelength and derivatization regent,the method has a stable baseline，high sensitivity，wider linear range，higher recoveryand reproducible.

solid beverages；Y-aminobutyric acid；HPLC；dansyl-Cl

TS278

A

1673-6044（2016）04-0059-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.016

*吳蓉，女，1990年出生，2014年畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境工程專業(yè)，碩士，助理工程師。

2016-11-16