余紹蕾 杜偉春 鴨喬

（云南綠A生物工程有限公司，云南昆明650106）

酶解結(jié)合物理法對(duì)雨生紅球藻破壁處理的工藝研究

余紹蕾*杜偉春 鴨喬

（云南綠A生物工程有限公司，云南昆明650106）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門（Chlorophyta）綠藻綱（Chlorophyceae）團(tuán)藻目（Volvocales）紅球藻科（Haematococcaccac）紅球藻屬（Haematococcus）。雨生紅球藻在特定生態(tài)環(huán)境中能形成厚壁孢子，積累大量的蝦青素，是自然界中能夠大量合成和積累蝦青素的生物，也是自然界中天然蝦青素含量最高的生物。近年來(lái)，由于天然蝦青素的超抗氧化功效得到了廣泛認(rèn)可，雨生紅球藻的需求量也不斷增加，其養(yǎng)殖、加工技術(shù)也在不斷地改進(jìn)。由于雨生紅球藻的孢子壁較厚，如不進(jìn)行破壁處理，蝦青素不易被提取，且吸收利用率低，故雨生紅球藻加工的關(guān)鍵技術(shù)之一就是破壁處理。傳統(tǒng)的破壁方法主要為物理法，但存在缺陷。本研究采用酶解結(jié)合物理技術(shù)對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行破壁處理，以期為雨生紅球藻破壁技術(shù)提供更好的方法。

1 材料與儀器

1.1 材料

雨生紅球藻粉，云南綠A生物工程有限公司；復(fù)合纖維素酶、復(fù)合果膠酶、復(fù)合多糖酶，諾維信（中國(guó)）投資有限公司。

1.2 試劑

二甲基亞砜（DMSO）、二氯甲烷、正己烷，均為分析純。

1.3 儀器

紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；高壓均質(zhì)破壁機(jī)，上海陽(yáng)溢生物科技有限公司；磁力攪拌機(jī)，鄭州新中原機(jī)器制造有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酶法-高壓均質(zhì)破壁工藝流程

精確稱取干燥的雨生紅球藻粉100 g，加入純化水900 mL，搖勻，加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH值，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)量加入復(fù)合果膠酶，控制反應(yīng)溫度緩慢攪拌，到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后，倒入均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓均質(zhì)，均質(zhì)壓力40 MPa，均質(zhì)2次。均質(zhì)后噴霧干燥，得破壁雨生紅球藻粉。

2.2 高壓均質(zhì)破壁工藝流程

精確稱取干燥的雨生紅球藻粉100 g，加入純化水900 mL，搖勻，倒入均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓均質(zhì)，均質(zhì)壓力40 MPa，均質(zhì)2次。均質(zhì)后噴霧干燥，得破壁雨生紅球藻粉。

2.3 破壁率檢測(cè)方法

2.3.1 二甲基亞砜提取及蝦青素含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量藻粉W1mg（約20 mg）于10 mL離心管中，加入5 mL DMSO，70℃提取5min，提取過(guò)程中搖動(dòng)離心管，使藻粉與溶劑混勻，促進(jìn)蝦青素的提??；5 000 r/min離心5 min，收集上清液；重復(fù)提取1次，合并提取液，用DMSO定容至25 mL，充分混勻后取1 mL于10 mL容量瓶中，用DMSO定容后，用1 cm光徑比色杯，在530 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算樣品蝦青素含量：

式中：C1——樣品中蝦青素含量，%；

A1——530 nm處樣品的吸光值；

W1——稱取藻粉的質(zhì)量，mg。

2.3.2 二氯甲烷-正己烷提取及蝦青素含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量藻粉W2mg（約20 mg）于10 mL離心管中，加入5 mL二氯甲烷-正己烷（7∶3）混合溶液，室溫提取蝦青素，提取過(guò)程中搖動(dòng)離心管，使藻粉與溶劑混勻，促進(jìn)蝦青素的提?。? 000 r/min離心5 min，收集上清液；重復(fù)提取1次，合并提取液，用二氯甲烷-正己烷（7∶3）混合溶液定容為25 mL，充分混勻后取1 mL于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷-正己烷（7∶3）混合溶液定容后，用1 cm光徑比色杯在530 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算樣品蝦青素含量：

式中：C2——樣品中蝦青素的含量，%；

A2——530 nm處樣品的吸光值；

W2——稱取藻粉的質(zhì)量，mg。

2.3.3 破壁孢子率計(jì)算

式中：R——破壁孢子率，%；

C1——二甲基亞砜提取時(shí)樣品中蝦青素含量，%；

C2——二氯甲烷-正己烷提取時(shí)樣品中蝦青素含量，%。

2.4 酶解參數(shù)篩選

以酶的種類（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、酶添加量（D）為4個(gè)因素，分別設(shè)置3個(gè)水平，以破壁孢子率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

2.5 對(duì)比試驗(yàn)

分別以正交試驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，與物理破壁法得到的破壁率進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

由極差分析可知，各因素對(duì)破壁率影響的主次順序?yàn)椋好傅姆N類＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時(shí)間。根據(jù)正交試驗(yàn)確定的酶反應(yīng)最佳條件為：A2B2C2D2，即酶種類為復(fù)合纖維素酶，酶解溫度45℃，酶添加量0.5%，酶解時(shí)間5 h。

3.2 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，采用酶法-高壓均質(zhì)破壁法對(duì)雨生紅球藻粉進(jìn)行破壁，其破壁孢子率較高壓均質(zhì)法提高了18.07%，對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

雨生紅球藻的有效成分—蝦青素，存在于其厚壁細(xì)胞中，為使其含有的蝦青素能得以應(yīng)用，必須要對(duì)其進(jìn)行破壁處理。2011年國(guó)家衛(wèi)生部已批準(zhǔn)了雨生紅球藻粉為新資源食品，將其破壁處理后，提取出來(lái)的蝦青素可用于食品、保健食品、化妝品、藥品等諸多領(lǐng)域。傳統(tǒng)的破壁法主要是物理破壁法，包括高壓均質(zhì)法、超聲波法、冷凍法等。其中，高壓均質(zhì)法對(duì)高壓均質(zhì)機(jī)的要求較高，且生產(chǎn)中設(shè)備零件損耗較大，常常不能連續(xù)生產(chǎn)；超聲波法設(shè)備昂貴、批處理量少，不適合于大規(guī)模生產(chǎn)；凍融法能耗大、操作周期長(zhǎng)，且提取破壁效率低下。酶解法是近年來(lái)發(fā)展較為快速的提取方法之一，在中藥的提取中，常用其進(jìn)行預(yù)處理，可大大提高有效成分的提取效率。

本研究選用了酶法結(jié)合高壓均質(zhì)法進(jìn)行雨生紅球藻的破壁處理，以期能夠改善原高壓均質(zhì)破壁存在的問(wèn)題。孢子主要由纖維素、果膠、脂多糖等物質(zhì)給成，故選取了纖維素酶、果膠酶和多糖酶對(duì)孢子進(jìn)行處理，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用復(fù)合纖維素酶，酶添加量0.5%，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間5 h條件下，酶解法結(jié)合高壓均質(zhì)破壁效果最好；對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)合酶解法后，雨生紅球藻的破壁孢子率提高了18.07%。在生產(chǎn)過(guò)程中，此方法對(duì)設(shè)備的磨損大大減少，機(jī)器可正常連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。其作用機(jī)理可能是通過(guò)纖維素酶使雨生紅球藻孢子中的部分纖維素得以降解，從而降低孢子的硬度，利于后續(xù)高壓均質(zhì)的操作。酶解結(jié)合高壓均質(zhì)破壁相對(duì)于其他破壁法具有提取效率高、成本低、適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，有一定的推廣價(jià)值。

［1］高桂玲，成家楊，馬炯.雨生紅球藻和蝦青素的研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38（2）：297-304.

［2］周錦珂，李金華，葛發(fā)歡，等.酶法提取雨生紅球藻中蝦青素的新工藝研究［J］.中藥材，2008，31（9）：1 423-1 425.

［3］歐陽(yáng)琴，陳興才，黃亞治.雨生紅球藻提取蝦青素不同機(jī)械破壁方法的研究［J］.福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，33（1）：111-115.

［4］趙曉燕，朱海濤，畢玉平，等軍.雨生紅球藻中蝦青素的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37（4）：191-195.

［5］陳興才，歐陽(yáng)琴，黃亞治.雨生紅球藻物理破壁法提取蝦青素研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2007，7（2）：48-52.

［6］宋成英.酶解技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（8）：1 934-1 935.

Study of the cellwall-breaking process by enzyme combined with physical method for haematococcus pluvialis

YUShaolei*DUWeichun YA qiao

（Yunnan green A biological project Co.,Ltd，Yunnan Kunming 650106，China）

采用酶解結(jié)合物理法對(duì)雨生紅球藻的破壁工藝進(jìn)行了研究，以破壁孢子率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選酶解條件，對(duì)比試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，雨生紅球藻的最佳破壁工藝為：選用復(fù)合纖維素酶對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行酶解處理，酶添加量0.5%，酶解溫度45℃，酶解時(shí)間5 h，酶解后結(jié)合高壓均質(zhì)法進(jìn)行破壁，均質(zhì)壓力40 MPa，均質(zhì)2次。在此工藝條件下，雨生紅球藻的破壁孢子率較原工藝提高18.07%。酶解結(jié)合高壓均質(zhì)法用于雨生紅球藻粉破壁具有效率高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

雨生紅球藻；蝦青素；酶解；高壓均質(zhì)；破壁

Tostudy the cell wall-breakingprocess byenzyme combined with physical method for Haematococcus pluvialis.Methods:Cell wall-breaking rate was as the evaluation index.Orthogonal test method was used toconcern enzymolysis conditions,and verified by contrast experiment.Results:The enzymolysis conditions identified as:composite cellulose enzyme,addingamount of0.5%,enzyme solution temperature 45℃,enzymolysis time 5 h,homogeneous pressure 40 Mpa,homogeneous 2 times.Compared with the original method,cell wall-breaking rate ofnewmethod increased 18.07%.Conclusion:Enzyme combined with physical method is high efficiency,low cost for breaking Haematococcus pluvialiscell wall,and is suitable for industrialized production.

haematococcus pluvialis；astaxanthin;enzymolysis；high pressure homogeneous；cell disruption

TS254.7

A

1673-6044（2016）04-0038-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.010

*余紹蕾，女，1983年出生，2008年畢業(yè)于暨南大學(xué)藥理學(xué)專業(yè)，工程師。

2016-11-25