王姣嬌 李海波 鮑欣欣 姚輝

金銀花不同組分對甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制作用研究

王姣嬌 李海波 鮑欣欣 姚輝

目的篩選金銀花抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶的有效部位，為闡明金銀花有效抗流感成分物質(zhì)基礎提供科學依據(jù)。方法金銀花經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，分別測定不同組分對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作用，確定其有效部位。結(jié)果金銀花乙酸乙酯部位對神經(jīng)氨酸酶有較強的抑制作用，對H3N2和H1N1流感病毒神經(jīng)氨酸酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（243．18±18．47）μg/ml和（198．34±9．67）μg/ml。結(jié)論基于活性導向，明確了金銀花中對流感病毒神經(jīng)氨酸酶有抑制作用的組分，為闡明其抗流感物質(zhì)基礎及新藥開發(fā)具有指導意義。

金銀花；流感病毒；神經(jīng)氨酸酶

流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強、傳播速度快的疾病[1]。神經(jīng)氨酸酶是一種表面糖蛋白，在流感病毒的復制過程中起著重要作用。流感病毒神經(jīng)氨酸酶的晶體結(jié)構已確定，它是由相同亞基組成的四聚體。酶活性位點位于各亞基表面的一個口袋中，在已經(jīng)鑒定的所有A、B型流感病毒中，結(jié)構高度保守[2]。自從確定了流感病毒神經(jīng)氨酸酶的晶體結(jié)構與天然底物唾液酸的共晶結(jié)構以來，流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究取得了突破性進展。

目前已有多種流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑已上市，如扎那米韋（zanamivir）和達菲（tamiflu），其對甲型和乙型流感病毒均有效[3-4]。這些化合物對流感病毒療效確切，但應用過程中耐藥株的出現(xiàn)，以及其帶來的毒副作用使得這些藥物的使用受到一定的限制，開發(fā)新型基于抑制神經(jīng)氨酸酶活性的抗流感病毒藥物具有重要意義[5]。金銀花為常見中藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、涼散風熱、保肝利膽等多種功效。現(xiàn)以體外抗神經(jīng)氨酸酶作用為指標，對金銀花的有效部位進行篩選研究。

1 材料與方法

1.1 金銀花購買及其鑒定

實驗所用金銀花購自新疆百草堂大藥房，由新疆藥物研究所趙軍研究員鑒定。

1.2 金銀花組分制備

取金銀花粉末50 g，置5 L圓底燒瓶中，分別以1 000 ml的95%乙醇和70%乙醇各回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮（0.1 Mpa，50℃），真空干燥（0.1 Mpa，45℃，12 h），即得藥材乙醇提取物。

1.3 提取

將藥材乙醇提取物，以500 ml去離子水混懸溶解后，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和飽和正丁醇分別萃取5次，各萃取部位減壓濃縮（0.1 Mpa，50℃），真空干燥（0.1 Mpa，45℃，12 h），分別得到是石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

1.4 H3N2流感病毒神經(jīng)氨酸酶的制備

在長滿MDCK細胞的培養(yǎng)瓶中加入H1N1和H3N2流感病毒，培養(yǎng)液為（含牛血清白蛋白1.2 mg/ml，TPCK胰酶5 μg/ml，DMEM），35℃，5% CO2培養(yǎng)，待細胞完全病變后收集上清，1 500 rpm離心10 min，去除細胞碎片。上清液中加入NP-40，使終濃度為0.1%，作為原酶液，-70℃保存待用。

1.5 神經(jīng)氨酸酶抑制篩選模型的建立與驗證

神經(jīng)氨酸酶測定試劑盒購自碧云天生物試劑公司，按照試劑盒說明書操作。酶促反應過程如下: 在96孔板中加入70 μl神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液，10 μl神經(jīng)氨酸酶酶液，10 μl不同濃度的金銀花提取物（反應體系中終濃度為500 μg/ml），振蕩混勻后37℃孵育60 min，加入10 μl神經(jīng)氨酸酶熒光底物，再次振蕩混勻1 min，用熒光酶標儀檢測各孔熒光強度（F），激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為322 nm和450 nm。以扎鈉米韋為陽性對照。如抑制率大于50%則進行復篩，分5個濃度梯度，計算樣品對流感病毒NA的半數(shù)抑制濃度（IC50），實驗重復3次。

抑制率=（F酶對照-F空白對照）-（F標本-F空白對照）/（F酶對照-F空白對照）×100%

2 結(jié)果

金銀花的不同組份均有抑制H3N2流感病毒神經(jīng)氨酸酶的作用，結(jié)果見表1。

3 討論

根據(jù)統(tǒng)計，全球每年的流感病例為6～12億，其中重癥流感為300～500萬例，死亡25～50萬人，重癥流感的病死率可達8%。國外最新研究表明，65歲以上老年人因流感導致肺部感染的可能性是（1.25～2.28）/千人，對于那些患有慢性疾病的老人，因流感誘發(fā)肺炎的可能性更大。流感每年導致超過20 000人死亡，并使超過100 000人入院治療。

流感病毒屬于正粘液病毒科，RNA病毒，球型，直徑80～120 nm。依據(jù)其核蛋白（nucleoprotein，NP）抗原性的差異分成A、B、C三型，分別在基因組結(jié)構、多肽組成、感染性和致病性等方面存在差異；其包膜分內(nèi)、外兩層，內(nèi)膜由基質(zhì)蛋白M1構成；外層包膜由脂質(zhì)雙層構成，其上面嵌有三種病毒蛋白，即血凝素（hemagglutinin，HA）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，MP）[2]。在每個流感病毒的表面，大約有100個蘑菇形神經(jīng)氨酸酶糖蛋白分子，其在流感病毒的復制過程中起著重要作用，是抗流感藥物的重要靶點之一。

隨著抗流感藥物的廣泛使用，藥物的耐藥性問題日趨嚴重，給流感的防控帶來極大挑戰(zhàn)。結(jié)合中藥藥源豐富、價格低廉且作用靶點多樣等優(yōu)勢，遵從中醫(yī)辨證施治原則，按照“分子中藥學”和“方證組方”理論，以抗流感病毒為主攻方向，兼顧扶正固本治則，合理組方，在研制高效低毒的抗流感病毒和防治流行性感冒藥物中，中藥及其有效成分將展現(xiàn)更廣泛的適應性和優(yōu)越性，并具有廣闊的研究前景[5]。

金銀花（Flosloniceraejaponicae）藥材為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥花蕾或帶初開的花。金銀花的提取物用于生產(chǎn)金銀花注射液、銀黃注射液、雙黃注射液、雙黃連粉、金銀花流浸膏等多種制劑。金銀花還可與多種藥物配伍用來治療呼吸道感染、菌痢、急性泌尿系統(tǒng)感染，高血壓、各種皮膚病、小兒肺炎、腮腺炎、小兒風疹、闌尾炎等諸多病癥。

金銀花化學成分復雜，已發(fā)現(xiàn)的化學成分主要有揮發(fā)油類、黃酮類、有機酸類、三萜類等。文獻報道表明，以綠原酸、異綠原酸為主的有機酸類，以木犀草苷為主的黃酮類，還有部分的揮發(fā)性成分都是本品清熱解毒的有效成分[6-8]。綠原酸類化合物是金銀花的主要有效成分，包括綠原酸、異綠原酸和咖啡酸。其中異綠原酸為一混合物，它的異構體有七種，分別為4，5-二咖啡酸?？崴?、3，4-二咖啡酸?？崴?、3，5-二咖啡酸?？崴帷?，3-二咖啡酸?？崴帷?-阿魏?？崴?，4-阿魏?？崴?、5-阿魏?？崴峥沽鞲胁《咀饔檬墙疸y花清熱解毒的現(xiàn)代藥理基礎之一，對其有效部位的研究將為物質(zhì)基礎的闡明提供依據(jù)[9-10]。

天然產(chǎn)物神經(jīng)氨酸酶抑制劑新型流感病毒的潛在威脅和耐藥流感病毒株的不斷出現(xiàn)，嚴重威脅著人類的生命健康[11]。從植物中發(fā)現(xiàn)天然抗病毒活性化學物質(zhì)是開發(fā)抗病毒藥物的重要途徑，這也使得越來越多的研究人員希望從天然產(chǎn)物中找到一種新穎的神經(jīng)氨酸酶抑制劑來解決流感病毒株耐藥性的問題[12]。研究按照極性，將金銀花進行分組，并測定各個組分對流感病毒神經(jīng)氨酸酶的抑制作用，為新型抗流感病毒藥物的開發(fā)奠定基礎。

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Inhibitory Effect of Different Components of Honeysuckle on Neuraminidase of Influenza A Virus

WANG Jiaojiao LI Haibo BAO Xinxin YAO Hui Department of Clinical Laboratory, Nantong Maternity and Child Health Hospital, Nantong Jiangsu 226018, China

ObjectiveTo screen the effective parts of hamercopsin to inhibit the neuraminidase of influenza virus, and to provide scientific basis for elucidating the material basis of effective anti-influenza component of honeysuckle.MethodsThe honeysuckle was extracted with petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol, and the inhibitory effect of different components on the neuraminidase of influenza virus was determined.ResultsThe ethyl acetate fraction of flos lonicerae has a strong inhibitory effect on neuraminidase, the median inhibitory concentration (IC50) for neuraminidase of H3N2 and H1N1 influenza viruses was (243.18±18.47) g/ml and (198.34±9.67)g/ml, respectively.ConclusionBased on the activity-oriented, it is clear that the components of the hamisinchins have inhibitory effect on the neurospitase of influenza virus, and it is of significance to elucidate its anti-influenza material base and new drug development.

honeysuckle; influenza virus; neuraminidase

R243

A

1674-9316（2017）22-0098-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．22．049

江蘇省南通市應用基礎研究課題（MS12015020）

江蘇省南通市婦幼保健院檢驗科，江蘇 南通 226018

李海波