張 淳 張媛媛

基因測(cè)序技術(shù)在細(xì)菌性傳染病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

張 淳①?gòu)堟骆垄?/p>

基因測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最為重要的技術(shù)手段，經(jīng)過(guò)數(shù)十年發(fā)展，以其通量高、速度快及準(zhǔn)確性高而被廣泛應(yīng)用于疾病檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中。為此，對(duì)基因測(cè)序技術(shù)原理和發(fā)展歷程進(jìn)行綜述，系統(tǒng)介紹目前常見(jiàn)的一代、二代及三代測(cè)序技術(shù)方法的原理以及基于不同技術(shù)原理的各類(lèi)測(cè)序設(shè)備，探討各類(lèi)測(cè)序設(shè)備在細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中的選擇和應(yīng)用，并對(duì)測(cè)序技術(shù)在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用發(fā)展進(jìn)行綜述和展望。

基因測(cè)序；測(cè)序儀器；細(xì)菌性傳染?。换蚪M學(xué)；精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)

基因測(cè)序技術(shù)即測(cè)定DNA或RNA堿基排序的技術(shù)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最為重要的技術(shù)手段，為基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)rederick Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法核酸測(cè)序技術(shù)(亦被稱(chēng)為Sanger技術(shù))，揭開(kāi)了人類(lèi)解密地球生物遺傳物質(zhì)的序幕[1]。1990年，人類(lèi)基因組計(jì)劃(human genome project，HGP)正式啟動(dòng)，該項(xiàng)目利用Sanger測(cè)序技術(shù)首次完成了人類(lèi)染色體中所包含的30億個(gè)堿基對(duì)組成的核苷酸序列，并于2001年發(fā)表人類(lèi)基因組工作草圖，標(biāo)志著人類(lèi)基因組計(jì)劃成功[2]。二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)改變了過(guò)去的研究模式，給基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏基因組學(xué)研究提供了更為有力的技術(shù)工具，并逐步深入到精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究及細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中。

1 基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)用概述

細(xì)菌性傳染病是公共衛(wèi)生安全中的重要方面，關(guān)系到全社會(huì)公民的健康和生命安全。隨著交通越來(lái)越便捷，病原體也在全球范圍內(nèi)迅速擴(kuò)散，并不斷出現(xiàn)新的變異種類(lèi)。同時(shí)，散發(fā)的細(xì)菌感染也在不斷發(fā)生，無(wú)論是人畜共患病還是醫(yī)院內(nèi)感染，都可能造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件，威脅人類(lèi)健康。因此，在應(yīng)對(duì)細(xì)菌性傳染病的發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)散中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是病原體的快速檢測(cè)和溯源。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，主要包括形態(tài)檢查、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，涉及的實(shí)驗(yàn)較多、操作繁瑣、培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁多，且分辨率低，而微生物繁殖速度快，新毒株不斷出現(xiàn)，也使傳統(tǒng)檢測(cè)方法的效率大打折扣。而基因測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)無(wú)疑為細(xì)菌性傳染病的快速檢測(cè)、追蹤溯源提供了有效的技術(shù)方法和工具，極大地提高了細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)工作效率和作用。

自1995年迄今20年時(shí)間內(nèi)，已經(jīng)發(fā)布了3萬(wàn)余株細(xì)菌基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)和分析結(jié)果所組成的數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成了基于測(cè)序技術(shù)的細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警預(yù)測(cè)體系的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，而不斷更新的測(cè)序技術(shù)和更快、更小及更準(zhǔn)確的測(cè)序設(shè)備，以及更加低廉的測(cè)序成本，都使測(cè)序技術(shù)成為細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中最為重要的技術(shù)手段[3]。

2 測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用

2.1 一代測(cè)序技術(shù)

1977年，桑格測(cè)定的第一個(gè)基因組序列是全長(zhǎng)5，375個(gè)堿基的噬菌體X174[4-5]。Sanger測(cè)序法，即雙脫氧鏈末端終止法，這一技術(shù)是目前最為常用的第一代基因測(cè)序技術(shù)，其基本原理為，在測(cè)序反應(yīng)中只加入單端引物，并按照一定比例混入4種具有不同熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP)，使部分DNA鏈的延伸反應(yīng)由于缺乏3'-OH而終止，從而產(chǎn)生大量具有相同起始點(diǎn)和不同終止點(diǎn)的DNA片段，且這些片段只相差一個(gè)堿基；隨后，用高分辨率毛細(xì)管電泳分離這些片段，檢測(cè)器依次讀取片段末端的熒光信號(hào)；最后，利用計(jì)算機(jī)軟件將這些熒光信號(hào)解讀為DNA序列。Sanger法與其他測(cè)序技術(shù)的主要區(qū)別在于：在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中只能測(cè)定一條目的片段的堿基序列，具有目標(biāo)明確、結(jié)果精準(zhǔn)、通量小且讀長(zhǎng)長(zhǎng)的特點(diǎn)，其測(cè)序長(zhǎng)度可以達(dá)到1，000 bp，對(duì)于一些臨床上小樣本基因的檢測(cè)和鑒定具有很高的實(shí)用價(jià)值[6]。

第一臺(tái)商業(yè)化測(cè)序儀是由美國(guó)Applied BioSystems公司出品的ABI Prism 370A，其產(chǎn)量為1，000 bp/日。隨后，美國(guó)ABI公司又發(fā)布了第一臺(tái)毛細(xì)管電泳測(cè)序儀Prism 310，其采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，使含有4種熒光染料的測(cè)序產(chǎn)物在一根毛細(xì)管中電泳分離，極大提高了測(cè)序的精確度，其產(chǎn)量為5，000～15，000 bp/日。在測(cè)序技術(shù)商品化應(yīng)用的前20年中，美國(guó)ABI公司幾乎壟斷了整個(gè)測(cè)序市場(chǎng)，從早期的377到ABI 3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀以至于最新推出的3500系列，一代測(cè)序技術(shù)和設(shè)備被廣泛應(yīng)用于基因研究的各個(gè)領(lǐng)域。

到目前為止，Sanger測(cè)序仍然是作為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，也是二代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)基因檢測(cè)后進(jìn)行家系內(nèi)和正常對(duì)照組進(jìn)行驗(yàn)證的主要手段。同樣地，在細(xì)菌性傳染病的應(yīng)急檢測(cè)過(guò)程中，Sanger測(cè)序技術(shù)常常被用來(lái)作為細(xì)菌感染的確證手段，在獲得可靠線索之后，可根據(jù)線索設(shè)計(jì)引物對(duì)病原體的特異基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，獲得的基因序列經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)之后得到明確的病原體種類(lèi)信息；在細(xì)菌性傳染病預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中，基于Sanger測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了一系列的細(xì)菌性傳染病病原體檢測(cè)方法和病原體分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)，如AFLP、MLVA和MLST等，并被應(yīng)用于研究細(xì)菌的流行病學(xué)、群體生物學(xué)、致病性和進(jìn)化等領(lǐng)域[7-9]。

2.2 二代測(cè)序技術(shù)

一代測(cè)序的主要技術(shù)特點(diǎn)是測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)(800～1，000 bp)，準(zhǔn)確性高(可達(dá)99.999%)，但是成本高，通量低，已經(jīng)不能滿(mǎn)足大數(shù)據(jù)量產(chǎn)出和未知樣本測(cè)序的要求，這些缺點(diǎn)影響了一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)開(kāi)發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)誕生。第二代測(cè)序技術(shù)，亦被稱(chēng)為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)在極大降低了測(cè)序成本的同時(shí)，還大幅提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，在病原微生物的快速檢測(cè)、溯源及傳染病性疾病防控等公共衛(wèi)生方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

2.2.1 Solexa測(cè)序技術(shù)

Solexa測(cè)序技術(shù)原理、商業(yè)化設(shè)備和應(yīng)用。Solexa測(cè)序技術(shù)的核心思想是“邊合成邊測(cè)序”(seqencingby synthesis，SBS)，包含“DNA成簇”和“可逆性末端終結(jié)反應(yīng)”兩種核心技術(shù)。Solexa測(cè)序技術(shù)首先將DNA打斷到約100～500 bp大小，再將測(cè)序接頭連接到這些短片段上制成測(cè)序文庫(kù)，然后在含有接頭序列的芯片(flowcell)上將已連接接頭的DNA片段綁定在flowcell上，經(jīng)橋式PCR反應(yīng)，將每一個(gè)DNA片段擴(kuò)大百萬(wàn)倍，形成一個(gè)序列單一的模板簇。在接下來(lái)的測(cè)序反應(yīng)中，在每個(gè)循環(huán)過(guò)程里，分別標(biāo)記有4種熒光染料的dNTP和聚合酶被加入到flowcell中。互補(bǔ)的dNTP和DNA片斷的一個(gè)堿基配對(duì)，通過(guò)酶作用加入到引物上，并可通過(guò)堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的熒光基團(tuán)來(lái)提供檢測(cè)信號(hào)。熒光信號(hào)被CCD采集，CCD快速掃描整個(gè)陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過(guò)上述的結(jié)合，檢測(cè)可以重復(fù)數(shù)百個(gè)循環(huán)，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為堿基序列。與一代測(cè)序技術(shù)相比，Solexa測(cè)序技術(shù)具有通量高、成本低、準(zhǔn)確率高以及讀長(zhǎng)較短(單端＜300 bp)的特點(diǎn)[10]。

Illumina公司在2006年初開(kāi)始推出基于Solexa測(cè)序技術(shù)的商業(yè)化測(cè)序設(shè)備，第一代設(shè)備被命名為Genome Analyzer，GA系列，隨后推出了Hiseq平臺(tái)，包含Hiseq2000、2500、3000、4000以及高度集成的X-ten測(cè)序系統(tǒng)。同時(shí)，為了適應(yīng)不同客戶(hù)的需求，Illumina還推出了集高通量測(cè)序性能和臺(tái)式測(cè)序儀為一體的Nextseq平臺(tái)和通量小且更靈活的Miseq平臺(tái)。隨著這些測(cè)序平臺(tái)的推出與應(yīng)用，測(cè)序數(shù)據(jù)的產(chǎn)出量也由最初的1 Gb升級(jí)(GA I)到1.6～1.8 Tb，測(cè)序速度不斷加快，而單堿基測(cè)序成本則極速降低[11]。

Solexa測(cè)序系統(tǒng)是主流的測(cè)序設(shè)備，市場(chǎng)占有率高達(dá)70%，在細(xì)菌性傳染病的應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中，有許多成功應(yīng)用案例，如通過(guò)Hiseq2000系統(tǒng)全基因組分析表明，2011年德國(guó)大腸桿菌O104：H4菌株是不同的菌株重組而成的強(qiáng)毒株；利用全基因組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明農(nóng)場(chǎng)主飼養(yǎng)的綿羊?qū)⑿滦偷哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌mecC株傳染給了其主人[12]；Harris等[13]針對(duì)兒童醫(yī)院內(nèi)部感染的MRSA，通過(guò)MiSeq桌面式測(cè)序儀快速分析，最終發(fā)現(xiàn)醫(yī)護(hù)人員作為病菌攜帶者導(dǎo)致了兒童監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)的持續(xù)感染?？傊?，在現(xiàn)階段細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中，Solexa測(cè)序技術(shù)幾乎被應(yīng)用于所有環(huán)節(jié)當(dāng)中。

2.2.2 SOLiD測(cè)序技術(shù)

SOLiD測(cè)序技術(shù)原理、商業(yè)化設(shè)備和應(yīng)用。SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection，SOLiD)測(cè)序技術(shù)的核心思想是“邊連接邊測(cè)序”，其核心技術(shù)為“油包水PCR”和“連接酶測(cè)序法”。該技術(shù)的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法與Solexa技術(shù)類(lèi)似，然后通過(guò)雜交反應(yīng)將DNA文庫(kù)連接至磁珠，并將磁珠和PCR反應(yīng)成分液滴包裹在礦物油滴中，形成獨(dú)立的反應(yīng)空間，從而將測(cè)序模板進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序磁珠通過(guò)3'末端的修飾共價(jià)結(jié)合在SOLiD玻片表面，每個(gè)磁珠即一個(gè)檢測(cè)單元，可以獲得一條序列。SOLiD測(cè)序的測(cè)序基本原理是通過(guò)熒光標(biāo)記的8堿基單鏈DNA探針與模板配對(duì)連接，發(fā)出不同的熒光信號(hào)，從而讀取目標(biāo)序列的堿基排列順序。SOLiD技術(shù)準(zhǔn)確率達(dá)到99.99%，優(yōu)于其他二代測(cè)序技術(shù)，這是由于目標(biāo)序列的所有堿基都被讀取了兩次，而且連接測(cè)序技術(shù)避免了PCR反應(yīng)在高GC區(qū)域的低效，因此對(duì)于高GC含量的樣本，SOLiD系統(tǒng)具有非常大的優(yōu)勢(shì)[14]。

SOLiD3測(cè)序系統(tǒng)是ABI公司于2007年開(kāi)始投入用于商業(yè)測(cè)序應(yīng)用的儀器，2010年末又發(fā)布了最新產(chǎn)品—ABI 5500xl SOLiDTM System測(cè)序平臺(tái)(SOLiD5版本)，至近年來(lái)又發(fā)表了ABI 5500xl W SOLiDTM System測(cè)序平臺(tái)，目前該平臺(tái)單次運(yùn)行可獲得320 Gb數(shù)據(jù)，但其測(cè)序讀長(zhǎng)仍維持在單端75 bp，雙端50 bp的水平上，因此在外顯子測(cè)序和RNA測(cè)序方面仍有應(yīng)用，但在微生物研究和細(xì)菌性傳染病防控領(lǐng)域應(yīng)用較少[15]。

2.2.3 Roche 454測(cè)序技術(shù)

454測(cè)序技術(shù)原理、商業(yè)化設(shè)備和應(yīng)用。454測(cè)序技術(shù)，亦稱(chēng)為焦磷酸測(cè)序技術(shù)，其核心思想亦是“邊合成邊測(cè)序”，包含“油包水PCR”和“焦磷酸測(cè)序技術(shù)”兩種核心技術(shù)。該技術(shù)的建庫(kù)方法與上述二代測(cè)序技術(shù)文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)類(lèi)似，三者區(qū)別僅為測(cè)序接頭序列不同。油包水技術(shù)與SOLiD技術(shù)類(lèi)似，而磁珠在測(cè)序載體上的固定方式則完全不同，454技術(shù)需將磁珠放在一種特制的直徑約為44 μm小孔的PTP平板上，此種平板上每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)磁珠，通過(guò)這種方法來(lái)固定每個(gè)磁珠的位置，以便進(jìn)行接下來(lái)的測(cè)序反應(yīng)過(guò)程。使用這種空間區(qū)隔測(cè)序單元方法，更大程度地避免了光學(xué)信號(hào)的互相干擾，使454技術(shù)成為二代測(cè)序技術(shù)中讀長(zhǎng)最長(zhǎng)(可達(dá)到600 bp)的測(cè)序技術(shù)。測(cè)序方法采用焦磷酸測(cè)序法，在小孔中進(jìn)行PCR反應(yīng)，按照一定順序每個(gè)反應(yīng)周期僅加入一種dNTP，如果dNTP能與待測(cè)序列配對(duì)，則會(huì)在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會(huì)與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP，生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測(cè)序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出可見(jiàn)光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)處理而獲得最終的測(cè)序結(jié)果。其最主要的一個(gè)缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度，如當(dāng)序列中存在類(lèi)似于PolyA的情況時(shí)，測(cè)序反應(yīng)會(huì)一次加入多個(gè)T，而所加入的T的個(gè)數(shù)只能通過(guò)熒光強(qiáng)度推測(cè)獲得，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會(huì)在測(cè)序過(guò)程中引入插入和缺失的測(cè)序錯(cuò)誤[16-17]。

Roche 454測(cè)序系統(tǒng)是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營(yíng)二代測(cè)序技術(shù)的平臺(tái)，先后推出2個(gè)型號(hào)，即測(cè)序通量較高的GS FLX系統(tǒng)和通量較低的GS Junior系統(tǒng)。前者單次運(yùn)行可獲得400 Mb數(shù)據(jù)，后者則獲得35 Mb，二者均可在10 h內(nèi)完成上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)，測(cè)序反應(yīng)時(shí)間較前述兩種技術(shù)具有較大優(yōu)勢(shì)。Roche公司在2013年宣布，在未來(lái)3年內(nèi)逐步關(guān)閉454業(yè)務(wù)，因此，在近3年內(nèi)基于454技術(shù)的測(cè)序平臺(tái)未進(jìn)行硬件升級(jí)，這也導(dǎo)致454測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用范圍逐步縮小。

由于在NGS技術(shù)中454測(cè)序技術(shù)具有速度快、通量高、讀長(zhǎng)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高、一致性好及簡(jiǎn)便高效的優(yōu)勢(shì)，使其在微生物群落多樣性研究和細(xì)菌基因組從頭測(cè)序(De novo測(cè)序)中的應(yīng)用十分普遍。微生物群落多樣性以整個(gè)微生物群落基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，研究微生物的多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系的微生物研究方法[18]。這種研究方法在細(xì)菌性傳染病的應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中亦有應(yīng)用，例如基于16s rDNA序列的細(xì)菌性病原體檢測(cè)，相較于傳統(tǒng)方法，可以實(shí)現(xiàn)新病原識(shí)別和混合感染中的病原識(shí)別[19]。

2.2.4 Ion torrent測(cè)序技術(shù)

Ion torrent測(cè)序技術(shù)原理、商業(yè)化設(shè)備和應(yīng)用。454技術(shù)的發(fā)明人之一Jonathan Rothberg還發(fā)明了一種基于半導(dǎo)體芯片的測(cè)序技術(shù)-Ion Torrent。該項(xiàng)技術(shù)僅在信號(hào)檢測(cè)方面與454技術(shù)有所不同，在測(cè)序過(guò)程中不是通過(guò)檢測(cè)焦磷酸熒光顯色，而是通過(guò)檢測(cè)H+信號(hào)的變化來(lái)獲得序列堿基信息。該技術(shù)使用了一種布滿(mǎn)小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，可以檢測(cè)反應(yīng)池中的pH值的變化。當(dāng)離子感受器感受到H+信號(hào)，H+信號(hào)再轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，從而讀出DNA序列。Ion Torrent相比于其他測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)，不需要昂貴的成像設(shè)備，因此，設(shè)備成本較低，測(cè)序速度快，整個(gè)上機(jī)測(cè)序可在2～3.5 h內(nèi)完成[20]。

ABI公司基于Ion Torrent平臺(tái)推出了IonPersonal Genome Machine(PGM)Dx與Ion S5系列，二者的區(qū)別為Ion PGM Dx系統(tǒng)可以進(jìn)行雙向測(cè)序，更高通量的Ion Proton與S5系統(tǒng)卻并不支持雙向測(cè)序。這些硬件設(shè)備為不同需求的研究人員提供了不同的芯片與設(shè)備，通量從50 Mb到15 Gb不等，運(yùn)行時(shí)間也從2～7 h不等。ABI同時(shí)還基于這些平臺(tái)開(kāi)發(fā)了更多的配套設(shè)備和配套試劑盒，實(shí)現(xiàn)了臨床檢測(cè)的高度自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化[21]。

Ion Torrent在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用與454技術(shù)類(lèi)似，但是由于測(cè)序讀長(zhǎng)較短，在微生物群落多樣性中的應(yīng)用弱于454技術(shù)，后者的應(yīng)用范圍更廣。作為目前最快速的二代測(cè)序平臺(tái)，Ion Torrent在細(xì)菌性傳染病的應(yīng)急檢測(cè)中具有其他方法不可比擬的時(shí)間優(yōu)勢(shì)。2.3 三代測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，被稱(chēng)之為第三代測(cè)序技術(shù)。與前兩代相比，其最大的特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了對(duì)一個(gè)DNA分子的序列測(cè)定，也就是說(shuō)在測(cè)序過(guò)程無(wú)需進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增以擴(kuò)大檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，這就避免了PCR過(guò)程中所引入的偏差(Bias)和錯(cuò)誤(Error)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特殊序列的DNA片段的測(cè)序。

2.3.1 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)

單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)原理、商業(yè)化設(shè)備和應(yīng)用。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序法(single-molecule realtime sequencing，SMRT)是目前最常用的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序法，該技術(shù)核心為“零模波導(dǎo)孔”(zero-mode waveguides，ZMW)。SMRT技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號(hào)與周?chē)坞x堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來(lái)，便是利用了ZMW原理，ZMW的孔徑小于檢測(cè)激光波長(zhǎng)，能量不會(huì)輻射到周?chē)?，而是保持直線狀態(tài)(光衍射的原理)。當(dāng)激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個(gè)小范圍里，正好足夠覆蓋需要檢測(cè)的部分，使得信號(hào)僅來(lái)自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域，而孔外過(guò)多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。該技術(shù)的酶反應(yīng)與Solexa技術(shù)類(lèi)似，不同的是將專(zhuān)利的DNA聚合酶(該酶可保持長(zhǎng)時(shí)間酶活性)固定在孔的底部，讓環(huán)狀DNA模板通過(guò)ZMW。熒光標(biāo)記dNTP結(jié)合在每個(gè)孔的單分子模板上，通過(guò)激光或者成像設(shè)備記錄ZMW底部標(biāo)記在核糖核酸上的發(fā)射波長(zhǎng)的顏色與持續(xù)時(shí)間來(lái)進(jìn)行序列的讀取。SMRT的技術(shù)特點(diǎn)決定了SMRT具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)(平均讀長(zhǎng)＞4.5 kb)，速度快(每秒可以讀取10個(gè)堿基)的優(yōu)點(diǎn)，其準(zhǔn)確性則是依靠對(duì)單一模板的多次測(cè)序來(lái)實(shí)現(xiàn)糾錯(cuò)，使其最高準(zhǔn)確率與Sanger法相似[22]。

2010年4月，美國(guó)Pacific Biosciences公司正式發(fā)售第三代測(cè)序系統(tǒng)-PacBio RS系統(tǒng)，隨后又推出了PacBio RS II系統(tǒng)，系統(tǒng)設(shè)備和試劑的升級(jí)，帶來(lái)了更靈活的臨床應(yīng)用，更高的測(cè)序通量，以及更快的測(cè)序速度。

由于SMRT硬件設(shè)備高昂的價(jià)格，對(duì)樣本DNA質(zhì)量嚴(yán)苛的要求，使該設(shè)備的應(yīng)用具有一定的局限性。但是，因其無(wú)可比擬的超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、組裝結(jié)果高準(zhǔn)確度、較高的敏感性(可以檢測(cè)頻率在0.1%的minor variants)以及可檢測(cè)堿基修飾等特點(diǎn)，使該技術(shù)在細(xì)菌性傳染病的預(yù)警監(jiān)測(cè)過(guò)程中，尤其是對(duì)于新病原體的鑒定、特定基因元件檢測(cè)以及細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中具有明顯的優(yōu)勢(shì)[23]。

2.3.2 納米孔測(cè)序技術(shù)

納米孔測(cè)序技術(shù)原理、商業(yè)化設(shè)備和應(yīng)用。納米孔(nanopore)測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的最具應(yīng)用潛力的測(cè)序技術(shù)，納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過(guò)，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來(lái)進(jìn)行高通量檢測(cè)。納米孔測(cè)序技術(shù)的共同特點(diǎn)為：①超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，讀長(zhǎng)可達(dá)到數(shù)十Kb到100 Kb；②錯(cuò)誤率在1%～4%，且為隨機(jī)錯(cuò)誤，可通過(guò)提高測(cè)序通量解決；③測(cè)序通量高；④測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)可讀；⑤起始DNA在測(cè)序過(guò)程中不被破壞；⑥樣品制備簡(jiǎn)單且成本最低[24]。

2014年，第一個(gè)消費(fèi)級(jí)別的nanopore測(cè)序儀的原型機(jī)——MinION在Oxford Nanopore Technologies(ONT)誕生。MinION技術(shù)的核心為“蛋白納米孔測(cè)序”，其利用金黃色葡萄球菌α溶血素(Staphylococcus aureus toxin，α-hemolysin)制成納米孔(孔道蛋白)，并使ssDNA鏈穿過(guò)納米孔產(chǎn)生特定的電壓改變(K-mer)，相較于其他測(cè)序平臺(tái)只有1～4種信號(hào)而言，MinION的K-mer可有1000多種可能，尤其是當(dāng)DNA序列中存在堿基修飾的時(shí)候可以直接被測(cè)定。ONT先后推出了GridION、MinION和PromethION測(cè)序平臺(tái)，GridION是可以擴(kuò)展的測(cè)序系統(tǒng)，既可以單獨(dú)作為一臺(tái)儀器工作，又可以多臺(tái)連接，帶來(lái)更快的結(jié)果。MinION測(cè)序系統(tǒng)是一次性設(shè)備，只有手掌大小，可以直接連接筆記本電腦進(jìn)行測(cè)序，該款測(cè)序儀已經(jīng)完成了太空測(cè)序任務(wù)，其結(jié)果與地面結(jié)果無(wú)差別。另外一款納米孔測(cè)序設(shè)備PromethION則是通量最高的納米孔測(cè)序設(shè)備，體積與一臺(tái)平板電腦的大小類(lèi)似，包含了48個(gè)獨(dú)立流動(dòng)單元的高通量平臺(tái)，最多可以在2日內(nèi)輸出2～4 Tb的數(shù)據(jù)量[25]。

納米孔測(cè)序技術(shù)作為具有最優(yōu)應(yīng)用前景的測(cè)序技術(shù)，目前，在我國(guó)尚未可用的商業(yè)化設(shè)備，而在全球范圍內(nèi)，納米孔技術(shù)也尚未大規(guī)模的應(yīng)用于細(xì)菌性傳染病的防控和研究工作當(dāng)中。

3 總結(jié)與展望

隨著基因測(cè)序技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用和普及，以及對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量愈來(lái)愈高的要求，推動(dòng)了基因測(cè)序技術(shù)持續(xù)的高速發(fā)展[26]。經(jīng)過(guò)近40年的發(fā)展，從一代Sanger測(cè)序技術(shù)，發(fā)展至廣泛應(yīng)用的二代測(cè)序技術(shù)，直至日漸成熟的三代測(cè)序技術(shù)，每一次升級(jí)都得益于技術(shù)的革命性改變，可以說(shuō)已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)了高通量、自動(dòng)化及低成本的目標(biāo)。

就細(xì)菌性傳染病應(yīng)急和預(yù)警監(jiān)測(cè)工作的需求而言，二代和三代基因測(cè)序技術(shù)與一代基因測(cè)序技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)可以基本滿(mǎn)足要求，可在數(shù)小時(shí)至數(shù)日內(nèi)獲得可靠結(jié)果，是細(xì)菌性傳染病在應(yīng)急、預(yù)警監(jiān)測(cè)和溯源等必備的技術(shù)體系。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室在選擇基因測(cè)序技術(shù)和購(gòu)買(mǎi)測(cè)序設(shè)備時(shí)應(yīng)該充分考慮以下問(wèn)題：①測(cè)序數(shù)據(jù)量和讀長(zhǎng)要求；②單位時(shí)間內(nèi)的測(cè)序工作量；③核酸樣本質(zhì)量；④生物信息分析能力。

綜上所述，隨著對(duì)基因組信息更深層次的理解、基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和生物信息學(xué)分析軟件的革新，相信基因測(cè)序技術(shù)將在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更大的作用。

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Application of gene-sequencing technique in the monitoring of bacterial infectious diseases/ZHANG Chun, ZHANG Yuan-yuan//China Medical Equipment,2017,14(7):134-138.

Gene-sequencing technique is the most important techniques in the research of modern molecular biology. After decades of development, it has been widely used in disease detection and monitoring due to its high throughput, fast speed and high accuracy. Therefore, the principle and development process of gene-sequencing technique were summarized in this paper, and the principle of gene-sequencing technique of the first generation, the second generation and the third generation and all kind of gene-sequencing equipment based on various principle of technique were systematic introduced in this paper. Besides, the paper also explored and discussed the selection and application of various kind of gene-sequencing equipment in the emergency and early warning monitoring for bacterial infectious disease. On the other hand, the paper also summarized and prospected the application and development of gene-sequencing technique in biology and biomedical research.

Gene-sequencing; Sequencing instrument; Bacterial infectious diseases; Genome; Precision medicine

Department of Medical Engineering, Beijing Ditan Hospital Capital Medical University, Beijing 100015, China.

張淳,女,(1968- ),碩士，高級(jí)工程師。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程處，從事醫(yī)療設(shè)備管理及醫(yī)療設(shè)備選型采購(gòu)工作。

2017-04-05

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.07.035

1672-8270(2017)07-0134-05

R515

A

①首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程處 北京 100015