張黎聲，韓小晶，羅志榮，邵水金，葉曉春，牟芳芳，國海東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

論著·實驗研究

淫羊藿苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移作用的影響

張黎聲，韓小晶，羅志榮，邵水金，葉曉春，牟芳芳，國海東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

目的探討淫羊藿苷調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）遷移作用機(jī)制。方法CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。建立體外細(xì)胞缺糖缺氧模型，Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡。Western blot檢測淫羊藿苷處理后MSC表面基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l（SDF-1）受體趨化因子受體4（CXCR4）的蛋白表達(dá)。Transwell小室跨膜實驗觀察淫羊藿苷對MSC遷移的作用。結(jié)果0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明顯促進(jìn)MSC增殖，10 μmol/L淫羊藿苷抑制MSC增殖。經(jīng)體外缺糖缺氧處理后，0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明顯抑制MSC凋亡。淫羊藿苷可顯著促進(jìn)MSC CXCR4的蛋白表達(dá)，同時可提高M(jìn)SC跨膜遷移的數(shù)量。加入CXCR4拮抗劑AMD3100后，各組間細(xì)胞遷移數(shù)量無明顯差異。結(jié)論一定濃度淫羊藿苷可促進(jìn)MSC的增殖、存活和遷移，SDF-1/CXCR4信號通路參與淫羊藿苷調(diào)控MSC遷移的作用。

淫羊藿苷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；存活；遷移；信號通路

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的原始細(xì)胞。在一定條件下，干細(xì)胞可以分化成多種功能細(xì)胞，成為治療損傷性疾病極具潛力的療法。在心血管領(lǐng)域，近年來的臨床研究表明，干細(xì)胞移植在一定程度上有利于心功能的恢復(fù)[1]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植可降低大鼠心肌梗死后梗死面積，促進(jìn)血管新生和旁分泌[2-3]。然而，心肌梗死后局部微環(huán)境不利影響干細(xì)胞的存活，也限制了干細(xì)胞的遷移[4]。淫羊藿苷（icariin）是一種從淫羊藿中提取的異黃酮類化合物，可補(bǔ)腎壯陽、延緩衰老，增加心腦血管血流量、強(qiáng)心、降血壓和抗心律失常[5]。淫羊藿苷不僅可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[6]，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[7-8]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）的遷移，但其具體作用機(jī)制尚不明確[9]。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l（stromal cell derived factor-l，SDF-l）/趨化因子受體4（CXCL receptor 4，CXCR4）信號通路在干細(xì)胞歸巢、遷移和募集過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10]。因此，本研究探討SDF-1/CXCR4信號通路在淫羊藿苷調(diào)控MSC遷移中的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用干細(xì)胞移植治療心肌梗死等損傷性疾病提供實驗數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量（200±50）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號SYXK（滬）2014-0008，購入后直接用于原代MSC培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

胰酶、多聚賴氨酸、AMD3100和牛血清白蛋白（美國Sigma 公司），高糖DMEM和無糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），CCK-8試劑盒、Hoechst33342、PMSF和RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Transwell小室和24孔板（美國Corning Costar公司），SDF-1α（美國PeproTech公司），CXCR4抗體、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記二抗（美國CST公司）。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），IX53顯微鏡（日本Olympus），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）。

2 實驗方法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

將成年雄性SD大鼠脫頸處死，無菌條件下分離雙側(cè)股骨和脛骨。剪開骨兩端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有肝素的0.01 mol/L PBS沖洗骨髓腔至10 mL離心管內(nèi)，1000 r/min離心8 min。吸去上清液，用含15％FBS DMEM培養(yǎng)液混懸沉淀，均勻接種至培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％～80％匯合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

取第5代MSC，用0.01 mol/L PBS漂洗后，經(jīng)0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合消化液消化，收集細(xì)胞懸液，1000 r/min離心8 min，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液重新混懸沉淀后將細(xì)胞以5×104個/mL接種至96孔板中。用不同濃度的淫羊藿苷對MSC進(jìn)行刺激，分為0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷組，未加淫羊藿苷處理的作為對照組。加入不同濃度淫羊藿苷處理48 h后，CCK-8法檢測各組細(xì)胞吸光度（OD）值。取各組細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后，于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定OD值。

2.3 體外缺糖缺氧模型建立

參照Hori O等[11]方法自制缺氧盒，并加以改進(jìn)。在有機(jī)塑料盒的2個側(cè)面各建立1個通氣孔，分別用于進(jìn)氣和排氣，將95％ N2和5％ CO2的混合氣體通過進(jìn)氣孔通入缺氧盒中，通過排氣孔將盒內(nèi)氣體抽空和連接測氧儀。實驗分為對照組（未加淫羊藿苷）和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷組。將細(xì)胞接種至24孔板內(nèi)的滅菌蓋玻片上，培養(yǎng)24 h后從培養(yǎng)箱內(nèi)取出24孔板，吸去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，更換無糖無血清的DMEM，淫羊藿苷組分別添加相應(yīng)濃度的淫羊藿苷進(jìn)行處理。然后將24孔板放入自制無菌缺氧盒中，密封盒蓋，關(guān)閉通氣孔。通過排氣孔用50 mL注射器將缺氧盒中的氣體盡可能抽空。然后密封排氣孔，經(jīng)通氣孔通入體積分?jǐn)?shù)為5％ CO2和95％ N2的混合氣體，并通過測氧儀檢測盒中的氧氣含量。當(dāng)缺氧盒內(nèi)氧濃度低于1％時迅速密封通氣孔，然后將缺氧盒置于37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 Hoechst33342染色

各組細(xì)胞經(jīng)體外缺糖缺氧處理24 h后，棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，加入4％多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次后加入Hoechst33342染色液，室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，磷酸甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)。每孔隨機(jī)選取5個視野，分別計數(shù)凋亡和全部細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)5次，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（％）＝凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100％。

2.5 Western blot檢測CXCR4蛋白表達(dá)

實驗分為對照組和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷組。將MSC接種至6孔板中，不同濃度淫羊藿苷處理48 h，吸去上清液，經(jīng)0.01 mol/L PBS漂洗3次，每孔加200 μL預(yù)冷的含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解細(xì)胞后12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取各組蛋白30 μg，加入5×SDS上樣緩沖液，于沸水中煮5 min使蛋白變性。上樣后行電泳，至溴酚蘭剛跑出時終止電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，20 V條件下轉(zhuǎn)印60 min，使膠內(nèi)蛋白充分轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜用PBST浸濕后，移至含5％脫脂奶粉的平皿中，室溫脫色搖床

巢、黏附、血管穿透和在靶器官內(nèi)的增殖、存活的整個過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，MSC在體外培養(yǎng)后，其表面受體CXCR4的表達(dá)水平逐漸降低，導(dǎo)致MSC向心肌組織的募集減少。研究發(fā)現(xiàn)，對急性大腦中動脈梗死大鼠灌胃低劑量淫羊藿苷可顯著提高腦組織中SDF-1和CXCR4的表達(dá)，促進(jìn)大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)[16]。因此，移植淫羊藿苷預(yù)處理的MSC可能會提高干細(xì)胞治療心肌梗死的效果。

綜上所述，一定濃度的淫羊藿苷可促進(jìn)MSC的增殖、存活和遷移。SDF-1/CXCR4信號通路參與淫羊藿苷調(diào)控MSC遷移的作用。本研究可為臨床應(yīng)用干細(xì)胞移植治療心肌梗死等損傷性疾病提供實驗數(shù)據(jù)參考。

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Effects of Icariin on Migration of Mesenchymal Stem Cells of Rat Bone Marrow

ZHANG Li-sheng,HAN Xiao-jing, LUO Zhi-rong, SHAO Shui-jin, YE Xiao-chun, MOU Fang-fang, GUO Hai-dong
(School of Basic Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo explore the mechanism of icariin mediating migration of mesenchymal stem cells (MSC) in rat bone marrow.MethodsMSC proliferation was detected by CCK-8 test. Cell apoptosis was examined with Hoechst33342 staining after the establishment of cellular oxygen and glucose deprivation model. The protein expressions of CXCR4, the receptor of SDF-1, in the surface of MSC after stimulated by icariin were detected through Western blot. The migration of MSC was observed by Transwell chemotaxis assay.Results0.01 μmol/L, 0.1 μmol/L and 1 μmol/L of icariin could significantly promote the proliferation of MSC, while 10 μmol/L of icariin inhibited the proliferation of MSC. After treatment of oxygen and glucose deprivation in vitro, 0.1 μmol/L and 1 μmol/L of icariin could inhibit the apoptosis of MSC. Icariin could not only improve the expression of CXCR4 in MSC, but also increase the number of transmembrane migrated MSC. After the addition of CXCR4 antagonist AMD3100, there was no significant difference in the number of cell migration among the different groups.ConclusionIcariin with appropriate concentration can promote the proliferation, survival and migration of MSC. SDF-1/CXCR4 signaling pathway is involved in the regulation of MSC migration by icariin.

icariin; mesenchymal stem cell; survival; migration; signaling pathway

R285.5

A

1005-5304(2017)02-0044-05

2016-06-26）

（

2016-07-12；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金（81673729）；上海市自然科學(xué)基金（16ZR1437300）；上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目（14YZ053）

國海東，E-mail：hdguo8@hotmail.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.013