錢江輝 張秀磊 陳沁月 沙先誼

注射劑中小粒徑不溶性微粒對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響

錢江輝 張秀磊 陳沁月 沙先誼

目的 探討4種鹽酸氨溴索注射劑中小粒徑不溶性微粒在小鼠體內(nèi)對(duì)相關(guān)炎癥指標(biāo)的影響。方法 比較4種制劑不同劑量下所含不溶性微粒靜脈給藥后對(duì)小鼠血清及肺組織中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的影響；比較不同制劑高劑量所含不溶性微粒對(duì)小鼠肺和尾靜脈組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果A制劑低劑量組對(duì)小鼠血清NO水平?jīng)]有顯著性影響（P＞0.05），而其他各組與對(duì)照組相比NO水平均明顯降低，且呈一定劑量依賴關(guān)系；各制劑高劑量組小鼠血清MDA水平均明顯高于對(duì)照組，尤其是D制劑高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；各組中除A制劑和B制劑低劑量組外，其余制劑組小鼠血清SOD水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；B、C制劑高劑量組和D制劑低高劑量組小鼠肺組織中MDA水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；D制劑高、低劑量組小鼠肺組織中SOD水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而其他各組與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論鹽酸氨溴索注射劑中小粒徑不溶性微粒對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)有不同程度的影響。

鹽酸氨溴索；注射劑；不溶性微粒；炎癥；質(zhì)量評(píng)價(jià)

靜脈注射液中不溶性微粒可使患者出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，近年來已逐漸引起醫(yī)療人員的關(guān)注，如不溶性微?？稍斐删植拷M織缺血、嚴(yán)重肺功能障礙甚至病死[1]。目前，包括中國(guó)在內(nèi)各國(guó)藥典對(duì)注射劑中控制的不溶性微粒是＞10 μm和＞25 μm兩種粒徑，對(duì)于小于10 μm的不溶性微粒沒有控制要求[2]。在前期研究中已報(bào)道了注射劑中存在數(shù)量龐大的小粒徑不溶性微粒（平均粒徑為1 μm左右），并且粒子數(shù)量在同一品種不同上市制劑之間存在明顯差異性[3]。

目前，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)檢測(cè)方法及倫理方面原因，還難以從臨床研究中得到準(zhǔn)確證據(jù)。本研究以鹽酸氨溴索注射劑作為模型藥物，評(píng)價(jià)不同制劑中小粒徑不溶性微粒在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在為該藥物的臨床用藥安全提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料BALB/c小鼠90只，雌雄各半，年齡7～8，體重18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。鹽酸氨溴索注射液：A廠（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20140032，規(guī)格：15 mg:2 ml），B廠（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20041473，規(guī)格：15 mg:2 ml）；注射用鹽酸氨溴索：C廠（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20031344，規(guī)格：30 mg），D廠（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20050243，規(guī)格：15 mg）；甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA，美國(guó)）；其他試劑均為分析純；一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成生物試劑有限公司）；Sartorius BS210S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Synergy2多功能酶標(biāo)儀（BioTek，USA）。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸氨溴索注射液中不溶性微粒樣品的制備注射劑中不溶性微?；鞈乙喊凑找韵路椒ㄖ苽洌?廠家的鹽酸氨溴索注射液（對(duì)于注射用鹽酸氨溴索先采用滅菌用注射用水稀釋成15 mg/2 ml），使用0.2 μm孔徑濾膜過濾，濾膜上的殘留物用0.9%氯化鈉注射液沖洗定容。

1.2.2 動(dòng)物分組、給藥及組織樣品處理按隨機(jī)數(shù)字表法將Balb/c小鼠分為9組，每組10只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組和4種制劑給藥組，每個(gè)制劑又分為高劑量組（鹽酸氨溴索給藥劑量為40 mg/kg）和低劑量組（鹽酸氨溴索給藥劑量10 mg/kg）。A制劑高、低劑量組分別用A-H和A-L表示；B制劑高、低劑量組分別用B-H和B-L表示；C制劑高、低劑量組分別用C-H和C-L表示；D制劑高低劑量組分別用D-H和D-L表示；0.9%氯化鈉注射液組用NS表示。給藥組小鼠尾靜脈分別注射對(duì)應(yīng)劑量鹽酸氨溴索不溶性微?；鞈乙海B續(xù)給藥6 d；正常對(duì)照組每天給予0.2 ml NS，連續(xù)給藥6 d。治療結(jié)束后，采集小鼠眼底靜脈血，離心，收集血清，-80 ℃儲(chǔ)存；麻醉后處死小鼠取其右肺上葉一部分置于10%福爾馬林溶液中，剩余凍存。

1.2.3 血清和肺勻漿中NO水平測(cè)定[4-5]將Griess試劑的A、B液各取3 ml于10 ml離心管內(nèi)，混合均勻。取40 μl待測(cè)上清液加入酶標(biāo)條內(nèi)，再在各待測(cè)樣品中加入10 μl三蒸水，最后加入50 μl Griess試劑A、B混合液，于震板儀上震蕩10 min，于540 nm處檢測(cè)OD值，換算為NO濃度。

1.2.4 血清和肺勻漿中SOD與MDA水平測(cè)定按照試劑盒使用說明書，SOD采用氧化酶法檢測(cè)，MDA采用TBA法測(cè)定。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察制備肺組織、尾靜脈組織切片，采用HE染色觀察其組織形態(tài)學(xué)變化，并觀察肺組織中白細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中相關(guān)炎癥指標(biāo)的測(cè)定

2.1.1 對(duì)血清中NO水平的影響A制劑低劑量組對(duì)小鼠血清NO水平?jīng)]有顯著性影響（P＞0.05），而其他各組與對(duì)照組相比NO水平均明顯降低，且呈一定劑量依賴關(guān)系，見圖1。

圖1 鹽酸氨溴索注射劑中不溶性微粒對(duì)NO的影響(n=10)

2.1.2 對(duì)血清中MDA和SOD水平的影響各制劑高劑量組小鼠血清MDA水平均明顯高于對(duì)照組，尤其是D制劑高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2；各組中除A制劑和B制劑低劑量組外，其余制劑組小鼠血清SOD水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖2 注射劑中不溶性微粒對(duì)血清中MDA的影響(n=10)

2.2 肺組織勻漿中MDA和SOD炎癥指標(biāo)的測(cè)定B、C制劑高劑量組和D制劑低高劑量組小鼠肺組織中MDA水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4；D制劑高、低劑量組小鼠肺組織中SOD水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而其他各組與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖5。

圖3 注射劑中不溶性微粒對(duì)血清中SOD活性的影響(n=10)

圖4 注射劑中不溶性微粒對(duì)肺中MDA的影響(n=10)

圖5 注射劑中不溶性微粒對(duì)肺中SOD活性的影響(n=10)

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 對(duì)肺組織病理學(xué)的影響高劑量條件下各制劑小粒徑不溶性微粒對(duì)肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖6。

圖6 鹽酸氨溴索注射劑高劑量組中小粒徑不溶性微粒對(duì)肺組織的影響

肺組織切片結(jié)果表明：不同鹽酸氨溴索注射劑中小粒徑不溶性微粒對(duì)肺部組織形態(tài)學(xué)產(chǎn)生不同程度的影響。A制劑組觀察到小鼠細(xì)支氣管和血管正常，肺泡壁有輕微增厚；B制劑組可見輕微的肺泡壁增厚、肺泡腔內(nèi)紅染的滲出液和肺泡隔斷裂；C和D制劑組觀察到不同程度的肺泡壁增厚、肺泡腔內(nèi)見炎性滲出物和肺泡腔的縮小。

2.3.2 對(duì)尾靜脈組織病理學(xué)的影響A制劑組小鼠尾靜脈血管周圍纖維組織輕微至輕度損傷，其他三種制劑表現(xiàn)為不同程度的整個(gè)或部分血管壁結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，血管壁平滑肌纖維、彈性纖維及疏松結(jié)締組織等正常結(jié)構(gòu)消失呈均質(zhì)紅染，伴有混合型炎性細(xì)胞輕微浸潤(rùn)。見圖7。

圖7 鹽酸氨溴索注射劑高劑量組中小粒徑不溶性微粒對(duì)尾靜脈組織的影響

3 討論

3.1 4種鹽酸氨溴索注射劑中小粒徑不溶性微粒NO影響結(jié)果表明，小粒徑不溶性微粒能夠降低NO對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用從而對(duì)機(jī)體造成一定程度的損傷，并且這種影響程度與注射劑中不溶性微粒數(shù)量呈依賴關(guān)系，制劑間存在明顯差異性。血清和肺勻漿中SOD和MDA水平變化，結(jié)合肺部組織切片的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，注射液中小粒徑不溶性微粒在一定程度上可引起氧化應(yīng)激損傷，這可能是造成進(jìn)一步組織器官損傷的原因之一。各制劑組對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響程度具有明顯差異性，從各注射劑不溶性微粒的測(cè)定結(jié)果提示，小粒徑不溶性微粒數(shù)量是影響炎性因子釋放和肺組織損傷的關(guān)鍵性因素[3]。不溶性微粒的組成成分是否影響炎癥指標(biāo)的差異性，需要進(jìn)一步分析微粒主要成分和開展相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 炎性因子水平增高與氧化應(yīng)激密切相關(guān)過高的氧自由基水平可引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致局部組織細(xì)胞損傷和釋放炎性介質(zhì)，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，加速細(xì)胞損傷，形成惡性循環(huán)[6-7]。本研究中，注射劑中不溶性微粒導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)可能是誘發(fā)炎癥相關(guān)指標(biāo)改變的主要原因。研究中評(píng)價(jià)的僅是注射劑中去除藥物的小粒徑不溶性微粒對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響，對(duì)于注射劑中治療藥物尤其是具有抗炎抗氧化活性的藥物是否會(huì)降低不溶性微粒對(duì)炎癥相關(guān)指標(biāo)和臨床發(fā)生不良反應(yīng)的影響，需要進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究評(píng)價(jià)。

臨床靜脈給藥發(fā)生靜脈炎約70%與注射劑中不溶性顆粒有關(guān)[8-10]，通過本研究中尾靜脈組織切片結(jié)果表明，注射劑中小粒徑不溶性微粒在一定程度上可促使靜脈炎產(chǎn)生，并加重其損傷程度。

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The effect of the small size particle matters on the related indexes of inflammation

Qian Jianghui Zhang Xiulei Chen Qinyue Sha Xianyi

Objective To evaluate the effect of the small size particular matter from four kinds of ambroxol hydrochloride injections on mice inflammatory index.MethodsComparison of 4 different dosage under water insoluble particles after intravenous administration of nitric oxide in serum and lung tissue in mice(NO),malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) levels of influence;comparison of different preparations of high dose containing insoluble particles on lung tissue and the effect of tail vein structure in mice.ResultsPreparation of A low dose group has no significant influence on serum NO level(P＞0.05),while other groups compared with the control group NO level was significantly reduced,and in a dose-dependent manner;the preparation of high dose group serum MDA levels were significantly higher than the control group,especially the preparation of D high dose group.The differences were statistically significant(P＜0.05);each group except A preparation and formulation of B low dose group,the preparation group serum SOD levels were significantly lower than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);B,C preparation in high dose group and low dose group D preparation of mouse lung in the level of MDA was significantly higher than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the level of SOD D preparation of high and low dose of lung tissue in mice were significantly lower than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05),There was no significant difference between the other groups and the control group(P＞0.05).ConclusionThe small diameter particular matter of ambroxol hydrochloride injections had different effects on the related indexes of inflammation.

Ambroxol hydrochloride;Injections;Particular matter;Inflammation;Quality evaluation

R944

A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.12.004

復(fù)旦大學(xué)，上海 201203

錢江輝（1991-），碩士研究生。研究方向：藥物新劑型與新制劑

沙先誼（1976-），博士，副教授。研究方向：藥物新劑型與新制劑。E-mail：shaxy@fudan.edu.cn