周林宗，王干珍，易曉明，朱麗琴，彭君

（1. 國(guó)土資源部長(zhǎng)沙礦產(chǎn)資源監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南長(zhǎng)沙，410007；2. 楚雄師范學(xué)院，云南楚雄，675000）

光催化合成銀納米簇對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)

周林宗2，王干珍1，易曉明1，朱麗琴1，彭君1

（1. 國(guó)土資源部長(zhǎng)沙礦產(chǎn)資源監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南長(zhǎng)沙，410007；2. 楚雄師范學(xué)院，云南楚雄，675000）

以木瓜蛋白酶為模板，通過(guò)光催化法合成了光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好的銀納簇。研究發(fā)現(xiàn)，將一定濃度的半胱氨酸加入銀納米簇和銀離子的混合溶液后，混合溶液在365 nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)等離子共振吸收峰，且與半胱氨酸的濃度有良好的線性關(guān)系。因此，建立了半胱氨酸的紫外吸收光譜分析法，實(shí)現(xiàn)了0.5 μM～60.0 μM濃度范圍內(nèi)半胱氨酸的定量測(cè)定，檢出限達(dá)0.5 μM。這種檢測(cè)方法具有良好選擇性，常見(jiàn)的生物小分子均不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。

銀納米簇；光催化；紫外分光光度法；半胱氨酸

引言

類(lèi)似于金銀納米粒子等貴金屬納米粒子，因具有特殊光學(xué)性質(zhì)而引起人們關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用到生物標(biāo)記、細(xì)胞成像[1]、癌癥臨床診斷和治療[2]等各個(gè)領(lǐng)域。納米粒子是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的一種尺寸處于原子簇和宏觀物體交界過(guò)渡區(qū)域的一類(lèi)特殊微粒[3]。由于納米顆粒具有量子效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)[4]以及“宏觀量子隧道效應(yīng)”[5]，從而呈現(xiàn)出優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)[6]、電學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性[2]等。目前，合成銀納米粒子的方法有化學(xué)合成法[7,8]、種子培養(yǎng)法[9]、微乳液培養(yǎng)法[10]、輻射法[11]、超臨界流體法[12]等，但是這些方法都要用到大量有毒有機(jī)試劑和還原劑，會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定影響。另外，物理方法需要先進(jìn)設(shè)備和嚴(yán)格條件控制。一些作為模板分子的天然產(chǎn)物雖可用來(lái)合成銀納米粒子，但是時(shí)間控制以及嚴(yán)格的合成條件也給合成帶來(lái)了挑戰(zhàn)。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速及綠色的合成銀納米顆粒的方法令人期待。

半胱氨酸是廣泛存在于生物系統(tǒng)內(nèi)的一種具有還原性基團(tuán)琉基(-SH)的氨基酸[13]。半胱氨酸在人體內(nèi)具有重要作用，它是通過(guò)二硫鍵支撐蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)而與蛋白質(zhì)分子作用，從而具有許多包括新陳代謝等的生物功能[14]。傳統(tǒng)的檢測(cè)半胱氨酸的方法有高效液相色譜法、熒光光譜法[15]和電化學(xué)伏安法等。然而，這些方法需要昂貴復(fù)雜的設(shè)備，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，從而限制了其應(yīng)用，因此建立一種簡(jiǎn)單、快速、選擇性好的方法來(lái)檢測(cè)半胱氨酸具有重要意義。

綜合上述考慮，以木瓜蛋白酶為模板，利用光催化法合成了光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好的銀納米簇，并根據(jù)納米簇等離子共振吸收峰變化來(lái)檢測(cè)半胱氨酸（Cys），這是一種快速簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、低成本的新方法。首先，在紫外燈光照的情況下光催化合成銀納米簇，然后加入半胱氨酸，銀納米簇在365 nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)等離子共振吸收峰，且在365 nm處的吸光度變化與半胱氨酸的濃度有良好的關(guān)系，在0.5 μM～60 μM有很好的線性范圍，最低檢測(cè)限為0.5 μM。此外，選擇性明顯提高，其他生物小分子，包括氨基酸、葡萄糖、多巴胺等，均對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾?；谏鲜霈F(xiàn)象，最終建立了基于光催化合成銀納米簇紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

銀納米粒子溶膠的紫外-可見(jiàn)吸收光譜是通過(guò)UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本，島津）用10 mm×2 mm寬的石英比色皿測(cè)得；銀納米粒子的形態(tài)和大小使用JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡（日本電子公司，日本）觀測(cè)；制備Ag（Ⅰ）-木瓜蛋白酶化合物的攪拌器使用SZCL-2A 數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；紫外光照使用ZF-1型三用紫外分析儀（上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司）3 W燈進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)；QL-901漩渦混合儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）用于溶液混勻；實(shí)驗(yàn)中緩沖溶液的pH是通過(guò)PHS-25型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)所使用的試劑木瓜蛋白酶（國(guó)藥試劑化學(xué)試劑有限公司）、L-半胱氨酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海）、儲(chǔ)備液置于4℃冰箱避光保存、AgNO3（99.999 5%，Alfa Aesar）、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、葡萄糖。其他化學(xué)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)中所用的水為超純水（電阻率18.25 MΩ）。

1.2 紫外光催化合成木瓜蛋白酶包裹的銀納米粒子

實(shí)驗(yàn)使用王水洗過(guò)的玻璃儀器，在室溫下移取0.3 mL，50 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液于10 mL圓底燒瓶中，在均勻攪拌下快速加入新配制的2.4 mL 10 mM的AgNO3溶液，快速攪拌10 min 后，將該混合溶液轉(zhuǎn)移到5 mL的石英比色皿里，在365 nm紫外光照射30 min，溶液顏色由無(wú)色變?yōu)闇\棕黃色。然后將溶液轉(zhuǎn)移到試劑瓶中，在4℃的冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 半胱氨酸檢測(cè)

紫外分光光度法檢測(cè)半胱氨酸：首先，將50 μL的銀納米溶膠加入到1.5 mL的離心管中，然后加入不同體積的半胱氨酸（0.1 mM）到反應(yīng)體系中，快速震蕩30 s后，緊接著加入（20 mM，pH=5.6）B-R緩沖定容到1 000 μL，在漩渦儀上搖勻。實(shí)現(xiàn)用紫外分光光度法對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀納米簇的表征

金屬納米粒子在紫外可見(jiàn)光區(qū)有吸收帶或吸收區(qū)，這是由等離子共振激發(fā)或者電子躍遷所形成的，這是納米粒子尺寸效應(yīng)的表現(xiàn)，在塊體中是不存在的，而且銀納米粒子的紫外吸收峰一般在415 nm左右。因此觀察銀納米粒子的光學(xué)現(xiàn)象非常有意義。合成的銀納米簇通過(guò)紫外吸收光譜和掃描電鏡（TEM）來(lái)表征（如圖1）。銀納米簇最大吸收波長(zhǎng)在420 nm處。從TEM圖中看出制備的銀納米簇的外觀基本為球形，粒度分布均勻，顆粒粒徑小，粒徑大部分小于5 nm。

圖1 木瓜蛋白酶穩(wěn)定銀納米簇的紫外吸收光譜圖

2.2 半胱氨酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)利用紫外光催化合成的銀納米簇是首次報(bào)道的，實(shí)驗(yàn)中對(duì)銀納米簇檢測(cè)半胱氨酸的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，主要優(yōu)化了緩沖溶液和反應(yīng)體系的pH值。

2.2.1 緩沖溶液的選擇

為了得到穩(wěn)定的紫外吸收值，在相同銀納米簇里分別加入相同濃度不同種類(lèi)的緩沖溶液，然后再加入30 μM的半胱氨酸，反應(yīng)后掃描反應(yīng)體系的紫外吸收光譜，對(duì)比365 nm處的吸收值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出（如圖2所示），B-R緩沖條件下在365 nm處的紫外吸收增強(qiáng)得最多，所以選擇的緩沖溶液為B-R緩沖。

圖2 在365 nm處不同的緩沖溶液檢測(cè)半胱氨酸的紫外吸收值

實(shí)驗(yàn)條件：銀納米簇（通過(guò)木瓜蛋白酶估算）1.112 mg/mL，Ag+濃度：1.78 mM，半胱氨酸：30 μM，緩沖溶液濃度：20 mM，pH=7.0，反應(yīng)時(shí)間：20 min，反應(yīng)溫度：25 ℃。

2.2.2 pH值的優(yōu)化

緩沖溶液的酸度對(duì)半胱氨酸檢測(cè)的影響，實(shí)驗(yàn)中在銀納米粒子和半胱氨酸濃度不變的情況下，通過(guò)改變加入不同pH值的B-R緩沖溶液來(lái)控制反應(yīng)體系的酸度。pH值的酸度范圍是4～10，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。隨著pH值的增加，365 nm處的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)的pH為8時(shí)，365 nm處的紫外可見(jiàn)吸收值最強(qiáng)，有利于對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)，所以最終選擇檢測(cè)半胱氨酸時(shí)使用pH為9的B-R緩沖溶液。

圖3 不同pH檢測(cè)半胱氨酸在365 nm處的紫外吸收值

實(shí)驗(yàn)條件：銀納米簇：8 mg/mL；半胱氨酸：30 μM，反應(yīng)時(shí)間：20 min，反應(yīng)溫度為25 ℃。

2.3 選擇性實(shí)驗(yàn)

為了考察方法的選擇性，實(shí)驗(yàn)選用多種氨基酸、葡萄糖、多巴胺等進(jìn)行了研究。結(jié)果如圖4所示，可以得出具有較強(qiáng)還原性的1.5 mM多巴胺（DA）和葡萄糖（Glu）與銀納米團(tuán)簇反應(yīng)后會(huì)引起體系吸光度增加很少，這說(shuō)明本方法有較好的選擇性。

圖4 不同物質(zhì)與銀納米簇反應(yīng)在365 nm處的吸光度與空白樣品吸光度的比值

實(shí)驗(yàn)條件：銀納米簇：3.2 mg/mL，半胱氨酸的濃度為30 μM，其他物質(zhì)的濃度為1.5 mM，反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.4 光譜法對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，向銀納米簇溶液中加入不同濃度的半胱氨酸，當(dāng)半胱氨酸的濃度不斷增加，如圖5（a）所示體系在365 nm 處的紫外吸收峰逐漸增強(qiáng)，且其吸光度值與半胱氨酸濃度具有良好的線性關(guān)系（如圖5（b）所示），線性回歸方程為A/A0= 0.970 + 0.137 C，R2= 0.996 7，檢測(cè)下限為0.5 μM。

圖5 光譜法對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)方法的可行性，采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯龃朔椒ㄓ脕?lái)檢測(cè)半胱氨酸是可靠的。

表1 半胱氨酸分析結(jié)果

3 結(jié)論

以木瓜蛋白酶為模板，通過(guò)光催化法合成了光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好的銀納米簇，并根據(jù)納米簇的等離子共振吸收峰變化來(lái)檢測(cè)半胱氨酸（Cys），這是一種快速簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、低成本的新方法。這種方法首先在紫外燈存在的情況下光催化合成銀納米簇，然后加入半胱氨酸，在365 nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)等離子共振吸收峰，且在365 nm處的吸光度變化與半胱氨酸的濃度有良好的線性關(guān)系，在0.5 μM～60.0 μM有很好的線性范圍，最低檢測(cè)限為0.5 μM。該檢測(cè)方法對(duì)半胱氨酸具有高選擇性?；诖爽F(xiàn)象，最終建立了基于光催化合成銀納米簇紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)半胱氨酸的檢測(cè)。

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彭君(1981-)，通信作者，男，湖南人，博士。主要研究方向：光譜分析。

E-mail: pengjun6539@126.com

Photocatalytic Synthesis of Silver Nanoclusters for Detection of Cysteine

ZHOU Lin-zong2, WANG Gan-zhen1, YI Xiao-ming1, ZHU Li-qin1, PENG Jun1

(1. The Ministry of Land and Resources of Changsha Mineral Resources Supervision and Inspection Center, Changsha, Hunan,410007, China; 2. Chuxiong Normal University, Chuxiong, Yunnan,675000, China)

Silver nanoclusters (AgNCs) with excellent photostability and biocompatibility have been synthesized using photocatalysis method in which papain is used as a template. When cysteine (Cys) with certain concentration is added into mixed solution of AgNCs and silver ions, a strong absorption band near 365 nm could be found in their absorption spectra owing to localized surface plasmon resonance (LSPR) of produced AgNCs. The absorbance changes at 365 nm have a good relationship with Cys concentration. The present assay allows for the sensing of Cys in the range from 0.5 μM to 60.0 μM, with a limit of detection (LOD) as low as 0.5 μM. More importantly, this colorimetric method has high selectivity to Cys. Potential interferes, such as glucose and dopamine will not affect the detection of Cys.

Silver Nanoclusters; Photocatalytic; UV Spectrophotometry; Cysteine

O6

A

2095-8412 (2016) 06-1060-05

10.14103/j.issn.2095-8412.2016.06.001

周林宗(1962-)，男，云南人，副教授。主要研究方向：應(yīng)用化學(xué)。E-mail: zhoulinzong@163.com