余菁 馬越娥 史玉玲

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072)

·綜述·

真菌感染檢測方法的研究進展

余菁 馬越娥 史玉玲

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科，上海 200072)

近年來，隨著抗生素、免疫抑制劑和激素等的廣泛應(yīng)用，真菌感染有不斷上升的趨勢，真菌已成為醫(yī)院感染的常見病原菌之一。由于不同病原菌對抗真菌藥物的敏感性不同，能否準確診斷病原菌直接影響藥物的選擇。及時準確地檢測真菌感染以及確定菌種，在臨床治療中尤為重要。該文對真菌感染檢測方法的研究進展作一綜述。

真菌感染；病原菌；檢測方法

真菌感染是指一種或多種真菌侵犯機體組織，由真菌或其代謝產(chǎn)物引起的疾病,其范圍可從淺表感染到深部組織感染。近年來，真菌感染發(fā)生率不斷上升，真菌的繼發(fā)感染問題也越來越多[1]。真菌檢測對臨床的診斷與治療尤為重要，隨著真菌檢測技術(shù)的發(fā)展，有越來越多的方法可以應(yīng)用于真菌的檢測和鑒定。

1 真菌鏡檢

真菌鏡檢是應(yīng)用最為普遍的真菌檢查。最常用的是10%～20%KOH溶液涂片法，操作簡便，能夠快速判定有無真菌感染，但其不能鑒定菌種，而且由于缺乏顏色對比，需要觀察者有很熟練的檢查技術(shù)，導(dǎo)致存在5%～15%左右假陰性[2]。在KOH中加入二甲基亞砜 (DMSO)后可以快速溶解角質(zhì)而不需加熱，更容易辨認真菌結(jié)構(gòu)，并能與人工假象相區(qū)別。通過提高KOH濃度及添加滲透劑DMSO，可促進角質(zhì)細胞化學(xué)變性，使背景清楚，減少纖維織物和細胞間隙干擾，易于辨認，特別是針對指、趾甲標本有其優(yōu)越性[3]。此外，還有許多特殊的染色方法，可以使真菌結(jié)構(gòu)更加清晰可辨。

1.1 熒光染色

目前，多種熒光染料 (包括異硫氰酸熒光素、Solophenyl Flavine染料、Calcofluor White染料等)由于與真菌細胞壁的纖維素或幾丁質(zhì)有很強的親和力而被用于真菌的染色上，使各類真菌 (霉菌及酵母)的細胞壁產(chǎn)生熒光標記，包括皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌、曲霉及各類變異的菌絲結(jié)構(gòu),而且特異性高，反應(yīng)時間只需數(shù)秒鐘即可完成，大大提高了臨床真菌檢測靈敏度和效率。適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各種標本。熒光染色后，真菌 (菌絲和孢子)在鏡下為清晰的亮藍色，菌絲的橫隔結(jié)構(gòu)和孢子的出芽形態(tài)清晰可見，非常易于識別。特別是在KOH涂片中真菌孢子與脂肪滴有時很難鑒別，而熒光染色法對脂肪滴不產(chǎn)生標記，使得特異性大大提高，彌補了傳統(tǒng)的KOH涂片法在真菌數(shù)量少時檢出率不高的不足。已有許多文獻證實熒光染色法在真菌檢測中較傳統(tǒng)的KOH濕片法具有敏感性強、陽性率高的特點[4]。在具備熒光顯微鏡的條件下，熒光染色法可取代傳統(tǒng)的KOH濕片法，成為常規(guī)真菌鏡檢的一種優(yōu)良檢測方法[5]。

1.2 派克墨水染色

派克墨水染液的配制：用20%KOH溶液和派克墨水各半混勻即成。經(jīng)派克墨水染色的標本在鏡下菌絲、孢子均被染成藍色,而背景上的角質(zhì)細胞、脂滴、氣泡均不著色,對比鮮明,尤其利于馬拉色菌孢子與背景脂滴、氣泡的鑒別,在低倍鏡下即可迅速發(fā)現(xiàn)目標孢子。

1.3 乳酸酚棉藍染色法

乳酸酚棉藍染色是比較常用的一種染色方法，染色后菌絲和孢子呈深藍色，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，背景干凈，反差大。乳酸可殺滅真菌，棉藍可使其著色，甘油可使玻片長期保存[6]，可以提高鏡檢陽性率。

1.4 過碘酸雪夫 (PAS)染色

PAS染色鏡檢可看到真菌呈紅色或紫紅色，胞核藍色。其原理是由于真菌莢膜有多糖類物質(zhì)，過碘酸能氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基與無色品紅結(jié)合又能生成新的紅色品紅復(fù)合物。PAS對真菌染色特異性強，著色鮮艷，易觀察，比較簡單方便，是鑒別真菌非常好的方法，值得推廣[7-8]。目前多用于深部真菌病理切片的真菌染色。

1.5 芝加哥天藍染色

芝加哥天藍染色即用1 g固體芝加哥天藍加入到100 mL 10%KOH充分溶解用于涂片，鏡下可見藍色的孢子及菌絲，及淡紅色的皮屑等雜質(zhì)背景，形成鮮明的色彩對比，這對于在低倍鏡下或技術(shù)不夠熟練的觀察者，能更快速發(fā)現(xiàn)真菌的菌絲及孢子等特征結(jié)構(gòu)。芝加哥天藍涂片鏡檢提供了一個更快速、準確的診斷方法，已有用于淺表真菌感染檢查的報道[9]。

1.6 六胺銀染色

六胺銀染色使真菌菌絲和孢子呈明顯的黑褐色，細胞核紅色。其原理是用5%鉻酸氧化真菌內(nèi)的多糖化合物而暴露出醛基，醛基還原六胺銀成為黑色的金屬銀[8]。

1.7 其他

除上述染色方法外，還有蘇木精-伊紅 (HE)染色、革蘭染色、抗酸染色、嗜銀染色、吉姆薩染色、黏蛋白卡紅染色、子囊孢子染色、美藍染色、Seller染色、Gridley染色、Wright染色等多種方法可用于真菌的染色檢查。

2 真菌培養(yǎng)

真菌培養(yǎng)檢查是將待測標本在一定溫度和濕度下進行培養(yǎng)，2～4周后根據(jù)生長真菌的菌落形態(tài)和鏡下結(jié)構(gòu)進行菌種鑒定。臨床上常用真菌培養(yǎng)基有沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)、馬鈴薯培養(yǎng)基 (PDA)。SDA是將葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、瓊脂18～20 g加入燒杯或鋁鍋內(nèi)，加少量蒸餾水加熱溶解，待完全溶解后補足蒸餾水至1 000 mL，分裝試管，115℃ 10 min高壓滅菌。SDA主要用于臨床真菌常規(guī)培養(yǎng)。PDA即把鈴薯200 g，洗皮切成碎塊，加水煮沸20 min，紗布過濾，濾液中加入瓊脂20 g，葡萄糖20 g，加熱使之溶化，再補足蒸餾水至1 000 mL，分裝，高壓滅菌。PDA可用于真菌的培養(yǎng)及曲霉菌和青霉菌的鑒定。此外，還有許多常用的培養(yǎng)基[10]。

2.1 改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)不同用途可以將沙氏瓊脂培養(yǎng)基進行改良，加入維生素B 0.1 mg/mL，可以促進紫色毛癬菌和斷發(fā)毛癬菌生長繁殖；加入酵母浸膏5 mg/mL，可促進皮膚癬菌生長。

2.2 科馬嘉 (CHROMagar)顯色培養(yǎng)基

科馬嘉顯色培養(yǎng)基是一種新型的鑒定培養(yǎng)基，能對臨床常見的假絲酵母菌進行分離并根據(jù)菌落的顏色快速鑒定常見菌種[11]。根據(jù)培養(yǎng)基上生長菌落的顏色和形態(tài)進行判斷：綠色菌落為白色假絲酵母菌即白念珠菌，藍灰色菌落為熱帶念珠菌，粉紅色、邊緣模糊、有微毛的為克柔念珠菌，紫紅色為光滑念珠菌，白色為其他念珠菌屬。對于混合感染的標本，也可以根據(jù)菌落在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的不同顏色作出判斷。用科馬嘉顯色培養(yǎng)基快速鑒定常見念珠菌屬，目前已廣泛應(yīng)用于臨床真菌培養(yǎng)。

2.3 米飯培養(yǎng)基

米飯培養(yǎng)基即按1 g大米、3 mL水的比例放入試管或培養(yǎng)皿中，121℃ 15 min高壓滅菌備用?？捎糜阼b別非典型的羊毛狀小孢子菌和奧杜盎小孢子菌，還能促進許多皮膚癬菌產(chǎn)生其特征性分生孢子，有助于菌種鑒定。

2.4 玉米粉吐溫瓊脂

玉米粉吐溫瓊脂即將玉米粉50 g混于水中，65℃水浴1 h，過濾，蒸餾水補足1 000 mL，再加入葡萄糖2 g、瓊脂15 g、吐溫-80，121℃ 10 min高壓滅菌后分裝，冷卻后冰箱保存。它能促進紅色毛癬菌產(chǎn)生深紅色色素，可用于紅色毛癬菌的鑒別。如不加葡萄糖，玉米粉吐溫瓊脂可用作念珠菌鑒定的小培養(yǎng)，以促進白念珠菌假菌絲和厚壁孢子的形成，也會促進暗色孢科真菌孢子的形成。

2.5 尿素瓊脂

尿素瓊脂是將葡萄糖10 g、蛋白胨1 g、NaCl 5 g，KH2PO42 g，0.02%酚紅水溶液6 mL，蒸餾水1 000 mL混勻后調(diào)pH至6.8,加入瓊脂20 g，煮沸至瓊脂完全溶解，10 min高壓滅菌，取出后冷卻至45～50℃時，每450 mL培養(yǎng)基中加入抽濾滅菌的20%尿素溶液50 mL，混合均勻后分裝斜面，冷卻后備用。新生隱球菌等一些隱球菌和一些酵母能夠產(chǎn)生尿素酶，而許多其他酵母卻不能產(chǎn)生尿素酶，尿素酶能分解培養(yǎng)基中的尿素，并形成大量的氨，使培養(yǎng)基pH值升高而呈堿性，使酚紅指示劑變紅，因此尿素瓊脂可用于隱球菌的鑒定。另外皮膚癬菌的尿素酶試驗用含5%葡萄糖的此培養(yǎng)基，用于鑒別紅色毛癬菌和須癬毛癬菌。

2.6 其他

除上述培養(yǎng)方法，常用的培養(yǎng)基還有咖啡酸瓊脂，用于鑒別新生隱球菌；芽管實驗培養(yǎng)基，可鑒定白念珠菌；腦心浸膏瓊脂 (BHI)，雙相真菌可在該培養(yǎng)基上呈酵母相；卡菌鑒定培養(yǎng)基，鑒定奴卡菌與鏈霉菌；葡萄糖酵母汁蛋白胨液體基，可分離培養(yǎng)酵母菌；子囊瓊脂、石膏塊培養(yǎng)基，可培養(yǎng)酵母菌產(chǎn)生子囊孢子；Leeming和Notman培養(yǎng)基、橄欖油培養(yǎng)基、七葉苷瓊脂可用于培養(yǎng)鑒定馬拉色菌；皮膚癬菌鑒別瓊脂 (DTM)，用于鑒定皮膚癬菌等等。

3 真菌檢測方法的新進展

針對真菌感染，除了通過真菌培養(yǎng)菌落特征來鑒別常見菌種，目前有越來越多的新的真菌檢測方法，在檢測是否有真菌感染、抗真菌藥物有效性及準確鑒定各種菌種等方面起到了重要作用。

3.1 分子生物學(xué)檢測

目前，常用的分子生物學(xué)分型方法有很多，包括多聚酶鏈式反應(yīng) (PCR)、分子雜交、隨機擴增片段長度多態(tài)性 (RAPD)、脈沖場凝膠電泳 (PFGE)、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) (PCR-RFLP)、多位點序列分析 (MLST)、重復(fù)序列PCR、實時熒光定量PCR (FQ-PCR)、任意引物聚合酶鏈反應(yīng) (AP-PCR)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (SSCP)、DNA序列分析、基因芯片技術(shù)等。其中MLST技術(shù)是目前公認的最為權(quán)威客觀的分子分型方法[12-14]。其基礎(chǔ)是通過PCR技術(shù)，分析真菌rDNA和ITS核酸序列，從基因水平上分析各菌種之間的親緣關(guān)系，使得菌種鑒定更加準確、可靠。rDNA基因是一種串聯(lián)重復(fù)基因，其序列和重復(fù)次數(shù)有顯著的株間差異，可用于種水平的鑒定[15]。rDNA上的18S、5.8S、28S rDNA基因序列進化速率慢且相對保守，存在廣泛的異種同源性，其中小亞基18S rDNA序列常被用來研究屬及屬以上分類群的演化關(guān)系，大亞基28S rDNA中的D1/D2區(qū)域可用于屬及臨近等級的分類群[16]。rDNA間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)，由于進化相對迅速而具多態(tài)性，因而適合于等級水平較低的系統(tǒng)學(xué)研究。Schoch等提出rDNA ITS作為真核生物域的第二大界——真菌界的DNA條形碼，以利于真菌多型分類生態(tài)學(xué)和生物多樣性的研究[17]。

3.2 質(zhì)譜技術(shù)

20世紀80年代以來，有4種軟電離質(zhì)譜技術(shù)產(chǎn)生，分別為等離子體解吸質(zhì)譜技術(shù) (PD-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù) (MALDI-MS)、快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù) (FAB-MS)和電噴霧質(zhì)譜技術(shù) (ESI-MS)。其中，MALDI和ESI兩種技術(shù)突破性解決了極性大和熱不穩(wěn)定類蛋白質(zhì)以及相關(guān)生物大分子的測定問題，具有高靈敏度、高準確度等優(yōu)點。在此基礎(chǔ)上，相關(guān)衍生和串聯(lián)技術(shù)也不斷產(chǎn)生，如PCR-ESI-MS、MALDI-TOF-MS等。其中，MALDI-TOF-MS是目前應(yīng)用最為廣泛的一種質(zhì)譜技術(shù)[18]。它通過直接檢測生物標志物 (蛋白)鑒定病毒、細菌、真菌及分枝桿菌,具有高敏感性、高通量和快速的特點。不同真菌通過質(zhì)譜儀得到不同的蛋白質(zhì)圖譜,與數(shù)據(jù)庫進行比對,根據(jù)圖譜的匹配度,得出鑒定結(jié)果和相應(yīng)的鑒定分值,分值越高匹配度越好,結(jié)果越可信[19]。因此，質(zhì)譜法準確性依賴數(shù)據(jù)庫中菌株種類，實驗室需不斷更新和補充數(shù)據(jù)庫。質(zhì)譜技術(shù)在酵母菌屬鑒定應(yīng)用比較廣泛，數(shù)據(jù)庫已包括了大量臨床酵母菌的參考圖譜，常用于鑒定常見酵母菌 (白假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、克柔假絲酵母和近平滑假絲酵母)，準確率高[20]。Ranque等發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜儀對以下絲狀真菌鑒定效果較好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉和毛霉目，特別是臨床常見的曲霉菌。但是數(shù)據(jù)庫中只有少量的絲狀真菌參考圖譜，標本的制備程序復(fù)雜還需改進。另外，絲狀真菌的圖譜很容易受到真菌不同階段的產(chǎn)物包括孢子、子實體、表面菌絲和基內(nèi)菌絲體等的影響[21]。

3.3 1,3-β-D-葡聚糖定量分析 (G試驗)

所有真菌的細胞壁均含有1,3-β-D-葡聚糖，而其他微生物及人的細胞和細胞外液都不含這種成分。當真菌進入人體血液或深部組織后，吞噬細胞的吞噬、消化等作用使1,3-β-D-葡聚糖從胞壁中釋放出來，使其在血液及其他體液 (如尿液、腦脊液、腹水、胸腔積液等)中的含量增高,而在淺部真菌感染中不增高。因此，通過檢測血清或體液中1,3-β-D-葡聚糖的含量，可以更早、更靈敏、更直接反映深部真菌感染的程度。該辦法適用于除隱球菌和毛霉菌外的所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種和菌屬[22]。

3.4 半乳甘露聚糖檢測 (GM試驗)

GM是曲霉菌細胞壁的主要成分，被認為是曲霉菌感染后最早釋放入血的標志性抗原，其釋放量與菌量成正比，可以反映感染程度。GM實驗是侵襲性曲霉菌感染的早期診斷方法，有學(xué)者報道，外周血檢測出GM的時間比臨床癥狀早5～8 d，比經(jīng)驗性治療平均時間早12.5 d[23]。

3.5 流式細胞術(shù) (FCM)檢測

FCM適合對真菌細胞逐個進行快速多參數(shù)的精確測量，目前主要用于白念珠菌的檢測。以標準珠作為對照，可以測量真茵細胞的總DNA含量、細胞周期及增殖指數(shù) (PI)，若細胞總DNA含量相等，說明是相同種屬的菌株。同時，根據(jù)測出的細胞周期及增殖指數(shù)可以判斷真菌的生長情況。此外，F(xiàn)CM還是一種快速、準確的藥敏試驗方法。其原理是抗真菌藥物與真菌作用需要一定時間，通過藥物介導(dǎo)細胞損害，利用某些熒光染料不能進入活菌細胞，只進入死細胞并同其內(nèi)DNA或RNA結(jié)合產(chǎn)生熒光的特點，使用FCM檢測死細胞和活細胞的熒光值，借以區(qū)分死菌和活菌，并依據(jù)熒光強度的變化趨勢推斷最小抑菌濃度 (MIC)[24]。

3.6 電鏡技術(shù)

電鏡技術(shù)包括掃描電鏡、透射電鏡、超高壓電鏡、分析電鏡等。其中，應(yīng)用最多的是掃描電鏡。掃描電鏡對觀察研究真菌表面超微形態(tài)是一種重要的手段。在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌絲和大、小分生孢子，為真菌的病原學(xué)分類和抗真菌藥物篩選等方面提供形態(tài)學(xué)依據(jù)[25]。

3.7 活體共聚焦顯微鏡 (IVCM)

IVCM是一種活體生物檢查技術(shù)，通過對角膜組織進行三維空間的掃描，動態(tài)觀察角膜組織細胞形態(tài)，具有高分辨率、高圖像對比度的特點，且重復(fù)性好[26]。IVCM對感染性角膜炎中棘阿米巴性角膜炎及絲狀真菌性角膜炎的診斷具有重要應(yīng)用價值。2011年Vaddavalli對103例微生物檢查確診的阿米巴角膜炎或真菌性角膜炎使用IVCM檢查，發(fā)現(xiàn)敏感性為88.3%，特異性為91.1%，與金標準診斷結(jié)果的一致性非常好[27]，但很難對真菌的菌屬及類型進行鑒定。

3.8 傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法 (FTIR-ATR)

傅里葉變換紅外光譜分辨率高，可以反映微生物細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)甚至細胞核中的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、核酸及其大分子、水分等混合成分的分子振動信息。因其主要根據(jù)細胞中生物大分子的化學(xué)組分進行分類，結(jié)果與傳統(tǒng)的真菌分類系統(tǒng)有一定的差別。其與聚類分析方法相結(jié)合，使所有測試在種水平上都得到正確歸類，但在屬、科等種以上等級的分類結(jié)果跟傳統(tǒng)的真菌分類系統(tǒng)有差異。目前，傅里葉變換紅外光譜技術(shù)已成功應(yīng)用于細菌、真菌、酵母菌、放線菌等微生物的識別[28]。

4 其 他

此外，真菌藥敏試驗、組織病理、微生物自動鑒定系統(tǒng)、隱球菌莢膜抗原檢測、循環(huán)抗原檢測、循環(huán)抗體檢測、外抗原實驗、皮膚實驗等方法也可用于真菌感染的檢測和鑒定。

5 結(jié) 語

目前，對于皮膚及甲的真菌感染，最常用的還是真菌鏡檢和培養(yǎng)，熒光染色因其操作簡單、快速、靈敏度高的優(yōu)點也開始廣泛應(yīng)用于臨床。對于深部及皮下組織真菌感染，組織病理是診斷的金標準。G試驗、GM試驗和隱球菌莢膜抗原檢測是目前臨床常用的真菌血清學(xué)試 驗。分子生物學(xué)、流式細胞術(shù)等先進的診斷試驗由于種種原因，在我國各級醫(yī)院尚未能順利展開。新興的質(zhì)譜技術(shù)及其相關(guān)衍生和串聯(lián)技術(shù)憑借其快速、操作簡單、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點,相信在未來臨床致病真菌鑒定中將具有很大優(yōu)勢。隨著科研人員的不斷研究和科技的不斷進步，會有越來越多的技術(shù)應(yīng)用于真菌的檢測，為臨床診斷和治療提供指導(dǎo)。

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[本文編輯] 王 飛

余菁，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:2280994954@qq.com

史玉玲,E-mail:shiyuling1973@#edu.cn

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1673-3827(2017)12-0252-05

2017-02-12