■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

新型豬口蹄疫疫苗研究進(jìn)展

■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病傳染性強(qiáng)、傳播速度快、危害嚴(yán)重，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，接種疫苗是防控口蹄疫的重要手段。本文介紹了口蹄疫亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、表位疫苗、活載體疫苗、基因缺失/標(biāo)記疫苗和病毒樣顆粒疫苗等幾種豬口蹄疫新型疫苗的研究進(jìn)展情況，以期為口蹄疫的防控提供參考。

豬口蹄疫；新型疫苗；研究進(jìn)展

口蹄 疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，可感染豬、牛、羊等70多種動物[1]。FMD傳染性強(qiáng)、傳播快、流行范圍廣，且能以氣溶膠的形式遠(yuǎn)距離傳播，一旦發(fā)生，往往造成大范圍流行，不易控制和消滅，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。OIE將其列在15個(gè)A類動物疫病之首，我國將其排在一類動物傳染病的第一位。一年四季均可發(fā)病，多發(fā)于冬、春寒冷季節(jié)[2]。

口蹄疫病毒（FMDV）具有7個(gè)血清型，分別為O型、A型、C型、亞洲1型、南非1型、南非2型、南非3型[3]，80多個(gè)亞型。病毒很容易發(fā)生變異，各型之間均無交叉免疫性，同型各亞型之間免疫力差，給FMD的防控與凈化帶來了困難。目前，滅活疫苗是防控FMD所用的疫苗。然而，由于滅活疫苗生產(chǎn)成本昂貴，需多次免疫，且存在滅活不徹底引發(fā)疫情的風(fēng)險(xiǎn)，需研發(fā)FMD新型疫苗。目前FMD新型疫苗研發(fā)工作取得了一定的進(jìn)展，本文就研究情況進(jìn)行綜述，旨在為FMD防控提供參考。

1 亞單位疫苗

利用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物的抗原基因?qū)胧荏w菌或細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)出蛋白，提取純化后，加入佐劑制成的疫苗，稱為亞單位疫苗。焦穎等[4]利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)O型FMDV VP1基因，并用酵母表達(dá)的VP1蛋白免疫小鼠，然后通過ELISA檢測抗體水平。結(jié)果表明，酵母所表達(dá)的VP1蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答。

2 合成肽疫苗

合成肽疫苗是通過人工合成病原微生物的保護(hù)性多肽，并將其連接到大分子載體上，加入佐劑而制成的疫苗。唐華等[5]應(yīng)用兩種不同濃度的含 AF/72 株 FMDV VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35] 和3B[29-42]4個(gè)抗原表位的合成肽聯(lián)合CpG寡聚脫氧核苷酸(5′-TCGCGAA CGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3′)合成肽疫苗365和364在豚鼠上進(jìn)行了免疫效力評價(jià)，并設(shè)置滅活疫苗免疫組和PBS對照組。結(jié)果顯示，2.5μg/只的合成肽364能保護(hù)4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻擊，滅活苗組獲得完全保護(hù)，其他組的保護(hù)效力僅為3/5，保護(hù)效力最高的兩組的外周血CD4+T淋巴細(xì)胞含量高達(dá)33.7%和36.6%，而其他組不超過27.7%，PBS組僅為18.1%。

3 核酸疫苗

將病原基因克隆入真核表達(dá)載體上，經(jīng)篩選后，獲得正確的重組質(zhì)粒，免疫動物后，外源病原基因可在動物機(jī)體表達(dá)，激活針對該病原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類疫苗稱為核酸疫苗。王曉虎等[6]構(gòu)建了單獨(dú)含F(xiàn)MDV VP1、VP4基因或同時(shí)含兩種基因的的重組核酸疫苗，將3種核酸疫苗免疫動物后，檢測免疫原性，結(jié)果顯示，這3種疫苗質(zhì)粒均能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且具有一定的保護(hù)效力。VP1單表達(dá)組和聯(lián)合組保護(hù)率均為28.6%，共表達(dá)組和融合表達(dá)組保護(hù)率均為42.9%，滅活疫苗組保護(hù)率為100%，空載體組保護(hù)率為0。

4 表位疫苗

表位疫苗是指利用基因工程方法體外表達(dá)或人工合成病原微生物的抗原分子表位，將其作為抗原研制成的疫苗[7]。李艷麗等[8]采用FMDV衣殼蛋白VP1G-H環(huán)132～160位和C-端200～213位氨基酸序列置換豬PCV2衣殼蛋白的核定位信號序列，在大腸桿菌中表達(dá)嵌合FMDV表位的PCV2衣殼蛋白及完整的PCV2 ORF2蛋白。目的蛋白純化后，進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性蛋白與PCV2、FMDV多克隆抗體有良好的免疫反應(yīng)性。將復(fù)性蛋白加聚肌胞苷酸(Poly I:C)與ISA206制備油佐劑疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示，復(fù)性與未復(fù)性蛋白均未能產(chǎn)生FMDV中和抗體，但產(chǎn)生了一定水平的FMDV特異性抗體。高明等[9]取O型FMDV 3個(gè)毒株VP1蛋白的優(yōu)勢表位，設(shè)計(jì)并合成重復(fù)串聯(lián)表位基因3FoEN2，并克隆豬IgG重鏈恒定區(qū)基因。將2個(gè)基因依次克隆到pProEX-HTb載體，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。誘導(dǎo)后，經(jīng)鑒定獲得目的蛋白表達(dá)。分別用5種佐劑ISA206、ISA201、IMS1313、603、ISA61乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠，并檢測免疫效果。結(jié)果顯示，重組蛋白能與感染O型FMDV的豬的陽性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，ISA201佐劑試驗(yàn)組刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平最高。項(xiàng)林盛等[10]以1株O型FMDVVP1基因?yàn)槟０?，根?jù)畢赤酵母密碼子偏嗜性，設(shè)計(jì)合成了含有T細(xì)胞表位(21-40 aa)和B細(xì)胞表位(129-169 aa)的多肽基因TB60，構(gòu)建成分泌型重組酵母表達(dá)載體pGAPZαA-TB60，線性化后，用電穿孔法轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，經(jīng)博萊霉素篩選及PCR檢測后，獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子；經(jīng)誘導(dǎo)后，該多肽能以分泌物形式在上清中表達(dá)，免疫動物后，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，有良好的免疫原性。

5 活載體疫苗

將外源病原基因插入到已經(jīng)弱毒的活病毒或通過特定的質(zhì)粒導(dǎo)入無毒力的細(xì)菌體內(nèi)，免疫動物后，外源病原基因可在動物體內(nèi)表達(dá)，這類疫苗稱為活載體疫苗。李婧靜等[11]根據(jù)減毒鼠傷寒沙門菌的密碼子偏好性將FMDV VP1進(jìn)行優(yōu)化，并將其插入pYA3341載體中，獲得重組質(zhì)粒pYA3341-VP1，將重組質(zhì)粒pYA3341-VP1依次轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌中間宿主X3730和表達(dá)宿主X4550中，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，并進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，在重組減毒沙門菌中，表達(dá)的FMDV VP1目的蛋白大小為23ku，與預(yù)期相符。秦曉冰等[12]構(gòu)建了含O型FMD結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組雞痘病毒或疫苗，免疫BALB/c小鼠后，檢測其免疫水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠能產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。王淼等[13]構(gòu)建了能表達(dá)A型FMDV VP1基因的重組乳酸桿菌pSIP411-VP1-NC8和pSIP411-VP1-WCFS1，將獲得的重組乳酸桿菌分別免疫豚鼠以檢測免疫效果，并設(shè)置空質(zhì)粒對照組pSIP411-NC8、pSIP411-WCFS1和陰性對照組，結(jié)果顯示，兩組重組乳酸桿菌免疫組抗體水平明顯高于其他3組，差異顯著，CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞含量明顯增多，脾淋巴細(xì)胞在抗原刺激后增殖明顯，可在血清中檢測到中和抗體。

6 基因缺失/標(biāo)記疫苗

采用基因工程技術(shù)將病原毒力基因缺失，從而使病毒毒力減弱，制成的疫苗免疫動物后，無毒性，只有免疫原性，稱為基因缺失疫苗，又稱“標(biāo)記”疫苗[14]。楊波等[15]利用反向遺傳操技術(shù)構(gòu)建了含組氨酸(His)標(biāo)簽的重組FMDV，該重組病毒能穩(wěn)定表達(dá)His標(biāo)簽。其對BHK-21細(xì)胞和乳鼠的致病性與親本毒株(rAsia1)類似，為新型疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。袁紅等[16]為研制針對我國邊境地區(qū)(尤其是西南邊境)流行的A型FMD(FMD)的標(biāo)記疫苗儲備病毒株，構(gòu)建了含A型FMD疫毒P1基因的O型FMD的嵌合型質(zhì)粒pO/3A91-105-AP1，NotⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)染BSR/T7細(xì)胞，拯救得到FMDV重組病毒。間接免疫熒光、RT-PCR和序列測定結(jié)果表明拯救的FMDV為正確的A型和O型間嵌合及3Aaa91-aa105缺失的重組病毒。病毒蝕斑和一步生長曲線表明拯救病毒的感染性和復(fù)制能力稍低于其親本病毒。

7 病毒樣顆粒疫苗

體外表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)病毒蛋白，能自動組裝成與天然病毒粒子類似的空心蛋白顆粒，不含病毒核酸，不能自動組裝成的復(fù)制，安全性好，免疫原性好，由此，制成的疫苗稱為病毒樣顆粒疫苗。董艷美等[17]根據(jù)豬源FMDV VP1上第141～160位氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)將該序列插入到大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)。然后連接到原核表達(dá)載體pET28a上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒28a-CP-VP1，轉(zhuǎn)化BL21，ITPG誘導(dǎo)表達(dá)得到融合表達(dá)的CP-VP1蛋白，透射電子顯微鏡下觀察融合蛋CP-VP1成類VLPs狀。間接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該蛋白能夠特異地結(jié)合豚鼠抗O型FMDV的陽性血清，30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生高效價(jià)的特異抗體。盛蓉等[18]以兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60為載體，分別在RHDV衣殼蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之間插入FMDV B細(xì)胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合VP60基因。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)嵌合蛋白，分別命名 VP60-2F、VP60-306F 和 VP60-578F。通過電鏡觀察嵌合蛋白自聚為病毒樣顆粒的能力，動物免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，將病毒樣顆粒免疫小鼠后均可產(chǎn)生針對VP60和B細(xì)胞表位特異的免疫應(yīng)答。

8 結(jié)語

我國是世界上口蹄疫多發(fā)國家之一，且疫情復(fù)雜，這與我國的地理環(huán)境密切相關(guān)，鄰國如越南、緬甸、泰國等國都有口蹄疫的暴發(fā)及流行。世界各國都很重視口蹄疫的防控工作，在國際貿(mào)易中口蹄疫是各國重點(diǎn)檢疫的疾病。安全有效的疫苗是成功防控乃至最終消滅FMD的重要條件。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，未來FMD疫苗研發(fā)的主要方向是盡快研制價(jià)格便宜、安全性好、免疫效果好的新型基因工程疫苗。FMD基因工程疫苗研制工作也取得了令人鼓舞的成就，制備了多種FMD基因工程疫苗，但這些基因工程疫苗也存在一些缺陷，如亞單位苗與全病毒疫苗比免疫原性差，需經(jīng)多次免疫才能獲得有效保護(hù)。合成肽疫苗容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶所降解，并且抗原位點(diǎn)也不一定能被所有的宿主動物識別，免疫原性較弱，使用效果并不理想。核酸疫苗長期使用后可能產(chǎn)生DNA抗體，對動物機(jī)體產(chǎn)生不良影響。表位疫苗還需要就FMDV抗原位點(diǎn)演變與表型間的關(guān)系進(jìn)行深入研究。接種活載體疫苗后可能會因?qū)d體病原產(chǎn)生相應(yīng)的免疫力，干擾目的病原基因的表達(dá)，還可能造成目的基因的丟失。病毒樣顆粒疫苗不易制備?？娠曇呙缈乖鞍椎谋磉_(dá)量較低。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，問題都會逐漸解決，畢竟新疫苗的研發(fā)是大勢所趨。目前，商品化的FMD合成肽疫苗投放市場，對其免疫效果有待于市場進(jìn)一步檢驗(yàn)，已經(jīng)通過國家新獸藥臨床試驗(yàn)審批的FMD基因工程疫苗還有復(fù)合表位蛋白疫苗、病毒樣顆粒疫苗及基因缺失標(biāo)記疫苗，相信未來FMD基因工程疫苗一定會替代滅活疫苗成為我國FMD防控的主力疫苗?！?/p>

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