□ 李云 石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心

□ 陳笑笑 王偉萍 杭州南開日新生物技術(shù)有限公司

水產(chǎn)品快檢技術(shù)在獸藥殘留方面的研究進展

□ 李云 石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心

□ 陳笑笑 王偉萍 杭州南開日新生物技術(shù)有限公司

水產(chǎn)品是人們生活中的重要食物來源，它的安全問題備受關(guān)注，其獸藥殘留問題更是敏感，目前已有多種快檢技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品獸藥殘留領(lǐng)域的檢測。本文主要概述了化學(xué)比色法、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法和量子點熒光免疫分析法等多種快檢技術(shù)在水產(chǎn)品獸藥殘留檢測方面的研究進展。

我國是世界上水產(chǎn)品產(chǎn)量最大的國家之一，作為餐桌上的佳肴，伴隨水產(chǎn)品需求量的不斷增長，安全問題也日趨嚴峻。水產(chǎn)品的安全風險主要來源于水體中的消毒劑、重金屬及飼料中的農(nóng)藥和獸藥殘留，其中，獸藥殘留問題較為突出。為避免水產(chǎn)品安全事故的發(fā)生，有效的獸藥殘留檢測技術(shù)必不可少。

快速檢測技術(shù)

目前，常規(guī)的檢測方法多為儀器分析法，其靈敏度和準確度都比較高，但存在費用高、檢測周期長等問題，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的需求，因此，簡單快速的檢測技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對化學(xué)比色法、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法和量子點熒光免疫分析法等多種快檢技術(shù)在水產(chǎn)品獸藥殘留檢測方面的研究進展作一綜述。

放射免疫測定法

1959 年，Yelow等建立了放射免疫測定法（RIA），其基本原理是標記抗原和非標記抗原對專一抗體的競爭抑制作用，利用了放射性示蹤的靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性。李佐卿等利用放射免疫法來檢測魚肉和雞肉中磺胺類藥物的殘留量，其中對魚肉樣品加標10μg/kg進行了18次測定，精密度為5.4%，測定低限能達到10μg/kg。陳鍵等研究了放射免疫法檢測鰻魚中磺胺類藥物殘留，驗證了磺胺類藥物在最大殘留限量50μg/kg時的檢測穩(wěn)定性，并且90min即可得到檢測結(jié)果。陳小雪等采用放射免疫法對水產(chǎn)品中氯霉素殘留進行了分析，檢測低限為0.15μg/kg。鄭晶等利用放射免疫法快速篩檢烤鰻中四環(huán)素類藥物殘留，檢測限為50μg/kg。目前，放射免疫測定法以其高靈敏度已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。

酶聯(lián)免疫吸附法

1971 年，瑞典學(xué)者Engvail和Perlman與荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs幾乎同時建立了檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫法（ELISA），其基本原理是酶與抗體或抗抗體共價結(jié)合，形成酶標記復(fù)合物，再與相應(yīng)的抗原形成酶標記的抗原抗體復(fù)合物，然后相應(yīng)的底物在酶的催化下反應(yīng)生成另一種有色產(chǎn)物。

周大勇建立了諾氟沙星的競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定法，其檢測范圍為10~500ng/mL，最小檢測濃度為4.6ng/mL。同時，周大勇測定了9種諾氟沙星類似物和一些抗菌素的交叉反應(yīng)率，其中洛美沙星的交叉反應(yīng)率最高，達到了64.18%，其余8種類似物的交叉反應(yīng)率均小于10%。采用這種方法測定草魚魚肉中的諾氟沙星含量，回收率為82.06%。李雅麗建立了基于多克隆抗體的間接ELISA方法來檢測喹諾酮，該法可用于豬肉和魚肉組織中19種喹諾酮類藥物的檢測，效果良好。

Umaporn等利用ELISA法測定蝦中5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）的殘留，檢出限為0.16μg/kg。Jester Edward等使用R-Biopharm公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒檢測了魚肉樣品中的硝基呋喃藥物殘留，與使用LC-MS-MS檢測的結(jié)果吻合度較高。李亞楠等建立了測定呋喃妥因代謝物的直接競爭酶聯(lián)免疫法，線性檢測范圍為0.177~11.508ng/mL，其中魚肉的最低檢測限為0.109μg/kg。

鄭晶利用酶聯(lián)免疫法來測定鰻魚中恩諾沙星的殘留量，當樣品濃度為0.3~10μg/kg時，最低檢測限為3μg/kg；當樣品濃度增加至25~100μg/kg時，回收率為66.5%~76.6%，靈敏度為0.3μg/kg。劉曉紅等利用酶聯(lián)免疫法測定鯉魚中恩諾/環(huán)丙沙星的殘留量，當濃度為10~810mg/kg時，最低檢測限為10μg/kg；當樣品添加濃度為20~500μg/kg時，回收率為76.6%~80.9%。李宗妍等建立了一步法酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中恩諾沙星的殘留，檢測限為10μg/kg，在10~40μg/kg濃度范圍內(nèi)，檢測回收率可達70%以上，檢測時間縮短至2h以內(nèi)。馮婷婷等利用抗恩諾沙星單克隆抗體建立了酶聯(lián)免疫吸附法用來檢測動物源性食品中恩諾沙星的殘留，檢測范圍為0.5~50μg/L，最低檢測限為0.2μg/L，在雞肉、魚肉、蝦和蜂蜜樣品中的回收率為93.3%~122.7%。

酶聯(lián)免疫吸附法的特異性強，且簡便快速，在水產(chǎn)品獸藥殘留快速檢測方面應(yīng)用廣泛，許多公司已具有商品化產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫吸附法作為目前研究較為成熟的快檢方法，在市場上占有較大份額。

膠體金免疫層析法

1971 年，F(xiàn)aulk和Taylor首次將膠體金應(yīng)用于免疫分析。此后，Osikowicz和Beggs等將膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于人類絨毛腺激素的定性檢測中，其基本原理是以膠體金（紅色）作為示蹤標記物，讓其與蛋白質(zhì)等多種大分子物質(zhì)結(jié)合，再利用抗原抗體反應(yīng)達到檢測目的。

韓靜等首次建立了同時檢測豬肉、雞肉、鯽魚中磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯噠嗪的多殘留免疫膠體金試紙條檢測方法，視覺檢測限為0.01mg/kg，檢測時間小于10min。馮婷婷等建立了同時檢測11種喹諾酮類藥物的膠體金免疫層析方法，對豬肉和蝦中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星的檢測限均為30ng/g，整個檢測過程（包括樣品前處理）可在20 min內(nèi)完成。吳茂生等利用膠體金免疫層析法對水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物殘留進行檢測，檢測限為1.0μg/kg，假陽性率低于5%，假陰性率為0，且通過液質(zhì)聯(lián)用法確證，兩者結(jié)果一致。張敏等研制出一種快速檢測水產(chǎn)品中磺胺類藥物的膠體金免疫試紙條，該試紙條對水產(chǎn)品中的磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶的檢出限分別是5μg/kg、40μg/kg、45μg/kg和100μg/kg，與四環(huán)素、鹽酸克倫特羅、環(huán)丙沙星、氯霉素等無交叉反應(yīng)，說明檢測試劑的靈敏度和特異性都較高。檀尊社等建立了一種用于快速檢測水產(chǎn)樣品中四環(huán)素類藥物殘留量的膠體金免疫層析法，最低檢測限可達100ng/mL，檢測僅需5~10min，且與沙丁醇胺等其他獸藥之間無交叉反應(yīng)。

膠體金免疫層析法是目前快檢市場上炙手可熱的檢測手段，其借助檢測試紙作為載體，操作簡便，檢測時間大大縮短，在水產(chǎn)品獸藥殘留方面有極大的應(yīng)用，而以此為基礎(chǔ)的大量研究也在進行中。

化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是Halman根據(jù)放射免疫分析的基本原理將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種方法。其操作流程是將發(fā)光物質(zhì)或酶標記在抗原或抗體上，免疫反應(yīng)結(jié)束后，加入氧化劑或酶底物而發(fā)光，通過測量發(fā)光強度，根據(jù)標準曲線測定待測物的濃度。

高彬文等建立了一種檢測魚和蝦肌肉中氯霉素殘留的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法，檢測限為5.8×10-4μg/kg，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比其更加靈敏。劉鄧等研制出一種基于魯米諾-辣根過氧化物酶體系的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，用于檢測食品中痕量恩諾沙星殘留，檢測線性范圍為0.024~2.76ng/mL，其中對魚肉和蝦肉樣本的添加回收率分別在92%~112%和86%~112%之 間。 謝體波等研究了化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對畜禽及水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測效果，發(fā)現(xiàn)試劑盒對豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉4種樣品的最低檢測限分別為0.097μg/kg、0.098μg/kg、0.097μg/kg、0.091μg/kg，靈敏度很高，且檢測只需要10min。

化學(xué)發(fā)光免疫分析法的推廣應(yīng)用速度非?？?，在快速檢測方面擁有巨大的潛力，同時化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用的研究也在不斷進行，有望催生出更好的食品安全檢測方法。

量子點熒光免疫分析法

1998 年，Chan等發(fā)現(xiàn)在牛血清白蛋白中，多克隆抗體能夠識別量子點標記的免疫球蛋白，使量子點聚集在一起。由此，量子點開始應(yīng)用于熒光免疫分析中，其基本原理就是將量子點作為示蹤標記物應(yīng)用于免疫層析法中。

Sai等建立了基于小分子半抗原直接包被方式和量子點熒光探針結(jié)合的新型熒光免疫分析方法，并將其用于檢測蝦仁中的氯霉素。該法的靈敏度為30.2ng/mL，最低檢出限為1.2ng/mL，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比，靈敏度提高約5倍，檢測時間縮短了1h。田瑋研究了用于檢測魚中氯霉素殘留的量子點熒光免疫分析法，其靈敏度高且檢測時間短。居瑩制備出具有免疫活性的量子點熒光探針，并組裝成孔雀石綠量子點免疫試紙條，其檢測限為1.5μg/kg。張蕾應(yīng)用CdTe量子點研制出呋喃唑酮快速熒光免疫層析試紙條，檢測了水產(chǎn)品蝦肌肉組織中呋喃唑酮代謝物的殘留量，檢測限為10.0ng/g，假陰性率和假陽性率均小于5%，且與呋喃西林代謝物、呋喃它酮代謝物和呋喃妥因代謝物的交叉反應(yīng)率均小于1%。

量子點熒光免疫分析法是量子點在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，彌補了傳統(tǒng)快檢方法靈敏度不高、抗干擾能力不強的缺點，促進了食品安全快速檢測技術(shù)的發(fā)展。

化學(xué)比色法

化學(xué)比色法主要包括試紙、試劑盒等，相對于其他快速檢測方法，是一種操作簡單的檢測手段，適用于大批量樣品的檢測。

竇紅建立了一種用于快速檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物的化學(xué)比色法，孔雀石綠及其代謝物的檢出限分別為2μg/kg和4μg/kg。錢蓓蕾等研究出了一種用于檢測孔雀石綠殘留的快速檢測試劑盒，檢測限為1.0~10.0μg/kg。

由于化學(xué)比色法的靈敏度較低，在水產(chǎn)品獸藥殘留快速檢測方面的應(yīng)用前景有限，目前不再著重于該法的研究，而是尋找更好的方法。

表面增強拉曼光譜

1974 年，F(xiàn)leischman等發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙銀電極表面上的吡啶分子可以得到增強的拉曼信號。隨后，Jeanmaire等證實了該光譜現(xiàn)象，表面增強拉曼光譜技術(shù)（SERS）由此產(chǎn)生，其基本原理是拉曼散射效應(yīng)產(chǎn)生的分子振動光譜，該光譜反映了分子的特征結(jié)構(gòu)信息。

顧振華等研究了使用便攜式拉曼光譜儀對水產(chǎn)品水樣中孔雀石綠進行快速檢測的方法，檢測限為5.0μg/L，常見物質(zhì)對其測定無干擾，且從樣品制備到結(jié)果顯示一般只需要3min。Zhang等建立了一種魚肉產(chǎn)品中恩諾沙星、呋喃唑酮和孔雀石綠的SERS分析方法，可以檢出羅非魚魚片中1.0μg/g的呋喃唑酮和200ng/g的孔雀石綠。隨后，該研究小組又利用SERS檢測魚肉中的孔雀石綠和結(jié)晶紫，檢測最低濃度分別為1.0μg/kg和2.0μg/kg。Fu等也建立了一種水產(chǎn)品中孔雀石綠的SERS分析方法，其線性范圍為2.5~100μmol/L，檢測限為2.5μmol/L。鐘堅海等將表面增強拉曼光譜與分子印跡和磁性納米技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了對養(yǎng)殖水和蝦肉中孔雀石綠的高效富集，檢測限分別為0.5ng/mL和6ng/g。

除了對孔雀石綠檢測的研究，表面增強拉曼光譜在抗生素檢測方面也有應(yīng)用。賴克強等對磺胺類抗生素進行了SERS探測，能夠檢測到的最低濃度為10ppb。隨后，研究小組又結(jié)合化學(xué)計量法快速檢測了水產(chǎn)品中磺胺甲基嘧啶的殘留，結(jié)果表明SERS技術(shù)對磺胺甲基嘧啶標準溶液的檢出限為5ng/mL，魚肉中磺胺甲基嘧啶的檢出限為20ng/mL。馬海寬等以銀溶膠為表面增強拉曼活性基底，檢測出磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低限度均為1ppm，檢測限分別為0.16ppm、0.59ppm，實現(xiàn)了魚肉中磺胺類抗生素的痕量檢測。

表面增強拉曼光譜無損樣品、可用于現(xiàn)場快速檢測的特點使其具有廣闊的應(yīng)用前景，但是其選擇性和數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較差極大地限制了該法的推廣，因此，需要進一步與其他技術(shù)相結(jié)合，進而加大對拉曼增強基底的研究。

水產(chǎn)品中的獸藥殘留是當前社會關(guān)注的熱點問題，也是人們生活中時刻關(guān)注的問題。除了從源頭上進行控制，還需要可靠的快速檢測技術(shù)作為支撐，保障人們的食用安全。目前，已有多家公司擁有成熟的快檢商品化產(chǎn)品用于現(xiàn)場快速篩查，且進一步的研究也在持續(xù)進行。本文簡要介紹了幾種用于水產(chǎn)品獸藥殘留的快檢方法，無論是已經(jīng)較為成熟的快檢方法，還是仍處于研究中的方法，都將為人們的食品安全提供一層屏障，相信未來還會有更多、更好的快檢技術(shù)誕生。