劉海英，陳建保，康 俊，張 浩，俎愛忠，景思遠(yuǎn)

（1.烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；2.烏蘭察布市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展與現(xiàn)狀分析

劉海英1，陳建保1，康 俊1，張 浩2，*俎愛忠2，景思遠(yuǎn)2

（1.烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；2.烏蘭察布市產(chǎn)品質(zhì)量計(jì)量檢測(cè)所，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

論述了馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，主要介紹了目測(cè)法、指示植物鑒定法、電子顯微鏡檢測(cè)法、血清學(xué)檢測(cè)法、分子生物學(xué)等檢測(cè)法，同時(shí)對(duì)每種檢測(cè)法進(jìn)行了簡(jiǎn)要評(píng)價(jià)，為從事馬鈴薯病毒檢測(cè)工作提供幫助。

馬鈴薯；病毒檢測(cè)；技術(shù)

目前對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)有影響的馬鈴薯病毒病有20多種，其中6種馬鈴薯病毒是我國(guó)目前檢測(cè)馬鈴薯病毒的必檢項(xiàng)目，包括馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯 S病毒 （PVS）、馬鈴薯 M病毒（PVM）、馬鈴薯A病毒（PVA），此外還有一種馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）屬于類病毒類，也是必檢測(cè)的指標(biāo)[1]。馬鈴薯病毒病會(huì)造成減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重的甚至可以達(dá)到80%以上。由于病毒具有個(gè)體小且專性依賴寄主的特性，所以對(duì)病毒進(jìn)行鑒定時(shí)技術(shù)要求很高。以前常根據(jù)病毒在寄主體內(nèi)寄生后的生物學(xué)特性來(lái)鑒別，隨著分子生物學(xué)發(fā)展，現(xiàn)在多采用病毒的核酸、病毒蛋白的分子生物學(xué)鑒別方法，提高了病毒鑒定的準(zhǔn)確性[2]。

1 觀察鑒定法

觀察鑒定法是根據(jù)不同病毒寄生在馬鈴薯植株上以后，植株將會(huì)表現(xiàn)出不同的癥狀，通過(guò)直接觀察植株癥狀來(lái)初步判斷是否感染病毒的一種方法。植株感染病毒后在田間所表現(xiàn)出的特征癥狀經(jīng)常還會(huì)受到寄主的品種、寄主的生育期、外界環(huán)境、病毒種類等方面因素的影響，所以該方法的準(zhǔn)確適用會(huì)受到觀察者實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的影響，只有觀察者具備豐富實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)才能做出準(zhǔn)確判斷，該方法只能起初步識(shí)別的作用，不能就此下最終結(jié)論[3]。此方法簡(jiǎn)便易行，不需要設(shè)備，但是要求鑒定者具有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

2 指示植物法

指示植物指的是能夠?qū)︸R鈴薯某一種病毒具有過(guò)敏反應(yīng)，被這種馬鈴薯病毒感染就能很夠快速表現(xiàn)出特定癥狀的一類植物，即鑒別寄主植物。該方法需要取待鑒定病株的任何組織部分進(jìn)行研磨制成汁，然后通過(guò)石英砂摩擦或者采用嫁接的方法將其接種到指示植物上，等到表現(xiàn)出癥狀后進(jìn)行觀察，根據(jù)只是植物的癥狀反應(yīng)來(lái)初步判定所接種待檢病株含有的病毒種類[4]。

該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需貴重的儀器設(shè)備和藥品，只要具有一定的空間和隔離條件，操作者具有豐富的癥狀判斷經(jīng)驗(yàn)就可實(shí)現(xiàn)，多數(shù)種薯生產(chǎn)者自己就能操作。但是，其存在主要問(wèn)題是培育指示植物需要一定的時(shí)間，需要提前準(zhǔn)備；指示植物需要占據(jù)一定的空間，要求提供一定的場(chǎng)地；另外，該方法靈敏度不夠高，所以同樣也不能作為最終鑒定的結(jié)果；不適用于鑒定大批量生產(chǎn)馬鈴薯試管苗，多應(yīng)用在鑒定病毒株系上，或者是在分子生物學(xué)鑒定之前進(jìn)行的初步鑒定。

3 電鏡檢測(cè)法

電鏡檢測(cè)法是利用電子顯微鏡來(lái)觀察待檢樣品中是否含有某種病毒。電子顯微鏡是通過(guò)電磁波作為光源，把感病植物的組織制成樣本，直接進(jìn)行觀察，依據(jù)病毒的大小、形態(tài)，以及一些典型的超微結(jié)構(gòu)等來(lái)判斷病毒的存在和種類。洪健等人[5]利用電子顯微鏡觀察煙草花葉病毒（TMV）以后，電子顯微鏡逐步發(fā)展成為研究植物病毒的常規(guī)手段。電子顯微鏡的分辨率非常高，甚至可以高達(dá)0.1 nm。但是由于電子束的穿透力比較低，這就對(duì)樣品的厚度有特殊要求，要求樣品厚度必須在10～100 nm。常用的電子顯微鏡檢測(cè)法主要有負(fù)染技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。負(fù)染技術(shù)的原理是通過(guò)將重金屬鹽堆積在樣品四周，加強(qiáng)了樣品外圍的電子密度，從而使得樣品顯示出負(fù)的反差，以此來(lái)襯托樣品的形態(tài)和大小。負(fù)染技術(shù)比超薄切片法簡(jiǎn)便、快速、分辨率高。而免疫電鏡技術(shù)是可以將免疫學(xué)原理結(jié)合電鏡技術(shù)，它不僅可以觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且可以判斷出病毒的血清學(xué)關(guān)系。張仲凱等人[6]通過(guò)免疫吸附電鏡技術(shù)鑒定出了馬鈴薯X病毒。該方法需要昂貴的儀器設(shè)備，操作過(guò)程復(fù)雜且操作技術(shù)要求高，必須經(jīng)過(guò)專業(yè)的學(xué)習(xí)才能很好地掌握，但是具備準(zhǔn)確度高、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)。

4 免疫檢測(cè)法

免疫法是指利用免疫學(xué)上病毒抗原與其相應(yīng)的抗體存在抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的原理，通過(guò)將特定的抗體標(biāo)記在載體上，然后與待檢測(cè)樣品接觸，如果發(fā)生了抗原抗體特異性反應(yīng)，就證明待檢樣品中存在相應(yīng)的病毒抗原，從而檢測(cè)出樣品中病毒的存在。在1927年首次應(yīng)用這種生物學(xué)上的免疫反應(yīng)方法研究了植物病毒的存在[7]。含有某一種病毒抗體的血清稱為該病的抗血清。植物病毒結(jié)構(gòu)中最外層的衣殼是蛋白質(zhì)，具有蛋白抗原的特性，通過(guò)提純植物病毒，然后將病毒注射在小動(dòng)物（小白鼠、雞等）體內(nèi)，在動(dòng)物體內(nèi)引起動(dòng)物體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，將會(huì)在血清中產(chǎn)生出相應(yīng)的抗體，采血后可得到該病毒的特異性抗血清。病毒的純化是制備抗血清的關(guān)鍵，提純的病毒純度越高得到抗血清的特異性就越強(qiáng)。

據(jù)免疫學(xué)原理現(xiàn)在已有多種鑒定病毒的方法了，在馬鈴薯病毒檢測(cè)上最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。ELISA法是利用抗原抗體特異性免疫反應(yīng)與高效酶催化反應(yīng)結(jié)合起來(lái)的原理，通過(guò)酶催化后的顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)到馬鈴薯中病毒的存在及其含量的多少，顯色反應(yīng)后顯示的顏色越重，證明病毒的含量就越多，可以使用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定出病毒。現(xiàn)在有多種試劑盒可供選擇，利用試劑盒法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果判斷較準(zhǔn)確、適用于大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)不斷發(fā)展和改進(jìn)，目前主要有直接法、間接法、雙抗體夾心法等多種檢測(cè)方法。

5 核酸雜交及PCR檢測(cè)法

植物病毒體內(nèi)的核酸是具有侵染寄主的能力，因此通過(guò)檢測(cè)核酸的存在是鑒定植物病毒更可靠的一種方法，目前常用核酸檢測(cè)法有核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法。

核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)（NASH）是利用核酸與自己的互補(bǔ)鏈可以互補(bǔ)結(jié)合，通過(guò)把標(biāo)記了的核酸單鏈制成探針，讓其與互補(bǔ)的待測(cè)病毒的核酸進(jìn)行雜交，如果雜交成功就證明待測(cè)核酸片段存在，從而證明含有核酸的病毒存在。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)植物病毒含有的是RNA，需要在擴(kuò)增DNA前把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增，故一般稱為RT-PCR法。此方法具有簡(jiǎn)便快速、高靈敏度、高特異性、高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。隨著不斷發(fā)展創(chuàng)新，目前有常規(guī)RT-PCR法、一步RT-PCR法、簡(jiǎn)并引物PCR技術(shù)、多元RT-PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR等多種PCR法。PCR檢測(cè)技術(shù)已成功應(yīng)用在檢測(cè)PVX、PVY、PVA、PVM、PVS、PLRV、PSTVd等的存在。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是最有發(fā)展前景的一種植物病毒檢測(cè)方法，具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、同時(shí)檢測(cè)多種病毒等優(yōu)點(diǎn)。采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)馬鈴薯上的PMTV、TRV和PVY的N株系，結(jié)果比常規(guī)RT-PCR檢測(cè)TRV的靈敏度增加了100倍。此方法具有簡(jiǎn)便快速、高靈敏度、高特異性、高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。

目前，提高馬鈴薯種薯質(zhì)量需要依賴馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)，靈敏度高又準(zhǔn)確可靠的病毒檢測(cè)方法對(duì)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要作用。另外，馬鈴薯病毒檢測(cè)費(fèi)用的降低也是普及擴(kuò)大馬鈴薯病毒檢測(cè)的重要影響因素。因此，馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)應(yīng)該朝著降低成本、提高靈敏度、縮短時(shí)間等方向發(fā)展，才能更好地滿足馬鈴薯病毒檢測(cè)的需求。而對(duì)于種薯生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)，在具備了病毒檢測(cè)技術(shù)的同時(shí)還應(yīng)該加強(qiáng)認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)對(duì)脫毒試管苗的病毒檢測(cè)，保證脫毒種薯的品質(zhì)，為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展從源頭提供保障。

[1]劉全永.馬鈴薯病毒檢測(cè)及其抗病毒基因工程研究進(jìn)展 [J].生物學(xué)通報(bào)，2001，36（1）：12.

[2]楊雪芹，向本春，施磊.馬鈴薯脫毒及脫毒苗檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展 [J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（8）：98-100.

[3]裘維蕃.植物病毒學(xué) [M].北京：科學(xué)出版社，1985：270.

[4]徐潔.指示植物鑒定馬鈴薯病毒技術(shù)的研究與應(yīng)用 [J].中國(guó)馬鈴薯，2002，16（2）：73-74.

[5]洪健，陳集雙，周雪平，等.植物病毒的電鏡診斷 [J].電子顯微學(xué)報(bào)，1999，18（3）：274-279.

[6]張仲凱，魏春紅.導(dǎo)致云南馬鈴薯品種中甸紅退化的PVX分離物提純及鑒定 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，16（1）：78.

[7]宋吉軒，范士杰，董穎蘋，等.應(yīng)用改進(jìn)的DAS-ELISA法快速檢測(cè)馬鈴薯病毒 [J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（5）：69-70.

Research Progress and Present Situation Analysis of Potato Virus Detection Technique

LIU Haiying1，CHEN Jianbao1，KANG Jun1，ZHANG Hao2，*ZU Aizhong2，JING Siyuan2
（1.Ulanqab Vocational College，Ulanqab，Inner Mongolia 012000，China；2.Ulanqab Product Quality Measurement and Testing Institute，Ulanqab，Inner Mongolia 012000，China）

This paper summarized the progressmade in the research about potato virus detection.It briefly introduced themethods ofvisual observation，indicator plants，electron microscopic method，sero-logical detection andmolecular biology，etc.It also provided a brief evaluation on eachmethod.

potato；virus detection；technique

S435.32

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.040

1671-9646（2017） 11b-0046-02

2017-09-28

內(nèi)蒙古質(zhì)檢系統(tǒng)科研項(xiàng)目（2015006）；內(nèi)蒙古教育廳高校研究項(xiàng)目（NJSY17566）。

劉海英（1975— ），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)轳R鈴薯組培及病毒檢測(cè)方面的教學(xué)和科研。*

俎愛忠（1973— ），男，本科，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楫a(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)。