王 璟，張家慶，白獻(xiàn)曉，高彬文，陳俊峰，張 彬，郭紫林，王華帥，邢寶松*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南興銳農(nóng)牧科技有限公司，河南信陽(yáng)465550）

葡萄糖對(duì)后備母豬繁殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

王 璟1，張家慶1，白獻(xiàn)曉1，高彬文1，陳俊峰1，張 彬1，郭紫林1，王華帥2，邢寶松1*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南興銳農(nóng)牧科技有限公司，河南信陽(yáng)465550）

為探討用葡萄糖代替鉻制劑調(diào)控母豬繁殖性能的可行性，將6頭70～80 kg大約克后備母豬隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加200 g/d劑量的葡萄糖，試驗(yàn)時(shí)間為21 d，采用ELISA方法測(cè)定血清中胰島素、孕激素和雌激素分泌量，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)繁殖相關(guān)基因表達(dá)量。結(jié)果表明，添加葡萄糖后，后備母豬血清中胰島素、孕激素和雌激素分泌量顯著增加，豬子宮中雌激素受體（ESR）、骨橋蛋白（OPN）、KISS1受體（GPR54）、孕激素受體（PGR）和視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）等繁殖相關(guān)基因表達(dá)量均顯著上調(diào)。以上結(jié)果提示，可以使用葡萄糖代替鉻制劑，通過(guò)刺激胰島素的分泌達(dá)到提高后備母豬繁殖性能的目的。

后備母豬；胰島素；繁殖性狀；基因表達(dá)；葡萄糖

后備母豬是指從出生到發(fā)情生理階段的母豬，該階段母豬對(duì)養(yǎng)殖業(yè)具有非常重要的作用，其繁殖性能直接關(guān)乎養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益。近些年，我國(guó)后備母豬面臨發(fā)情率低、配種率低等問(wèn)題，高淘汰率和低繁殖性能消耗大量的人力、物力、財(cái)力，嚴(yán)重威脅生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［1-2］，提高后備母豬的繁殖性能成為目前育種工作者研究的熱點(diǎn)。

胰島素對(duì)母豬的繁殖性能有很大影響，日糧能量等能夠通過(guò)胰島素經(jīng)早期生長(zhǎng)應(yīng)答基因-1（Egr-1）、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和神經(jīng)肽Y（NPY）等途徑作用于垂體，提高促性腺激素釋放激素（GnRH）、促黃體素（LH）和卵泡刺激素（FSH）等的分泌，這些激素作用于卵巢，促進(jìn)雌激素（E2）和孕激素（P）的合成與釋放，進(jìn)而促進(jìn)卵泡發(fā)育，對(duì)母畜的發(fā)情、受孕、胚胎發(fā)育、仔畜初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量等繁殖性狀具有重要影響［3-4］。研究表明，胰島素分泌不足而患有糖尿病的后備母豬，其卵泡閉鎖率較高［5］。在初情期前，外源胰島素處理能夠減少小母豬的卵泡閉鎖率［6］。劉巖等［7］使用不同質(zhì)量濃度胰島素刺激豬的顆粒細(xì)胞，隨著胰島素質(zhì)量濃度增加，顆粒細(xì)胞的數(shù)目及其分泌的雌激素量明顯升高，當(dāng)胰島素的質(zhì)量濃度達(dá)到10 ng/m L時(shí)，顆粒細(xì)胞分泌雌激素的質(zhì)量濃度達(dá)到最大。由此可見(jiàn)，胰島素對(duì)于母豬的卵泡發(fā)育具有重要作用。

研究證實(shí)，鉻能夠通過(guò)提高母豬機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性影響其繁殖性能，在生產(chǎn)中通過(guò)給初產(chǎn)母豬補(bǔ)飼鉻調(diào)節(jié)其繁殖性能，如吡啶羧酸鉻［8］、煙酸鉻［9］、蛋氨酸鉻［10］、皮革蛋白粉［11］等。然而，鉻作為重金屬元素，會(huì)促進(jìn)血液中部分蛋白質(zhì)沉淀，引發(fā)貧血、腎炎、神經(jīng)炎、呼吸道炎癥等疾病，長(zhǎng)期接觸甚至誘發(fā)肺癌等。因此，尋找其他物質(zhì)代替鉻元素促進(jìn)母豬胰島素的分泌是亟需解決的問(wèn)題。大量研究表明，葡萄糖是參與調(diào)控胰島β細(xì)胞合成分泌胰島素最為重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，一方面葡萄糖從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及翻譯3個(gè)水平促進(jìn)胰島素基因的表達(dá)量，此外葡萄糖通過(guò)第二信使途徑等誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞分泌胰島素［12-14］。與鉻相比，葡萄糖既安全又易獲取，但能否將其作為鉻的替代物來(lái)調(diào)控母豬繁殖性能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究通過(guò)在飼料中添加葡萄糖誘導(dǎo)母豬胰島素分泌，檢測(cè)其血清繁殖相關(guān)激素含量的變化，同時(shí)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其繁殖相關(guān)基因表達(dá)量的變化，驗(yàn)證葡萄糖對(duì)胰島素的誘導(dǎo)作用以及葡萄糖通過(guò)胰島素對(duì)母豬繁殖性狀的影響。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物及樣品采集

選取6頭70～80 kg大約克后備母豬（河南農(nóng)科種豬科技有限公司），每頭豬具有同樣的遺傳背景。將6頭豬隨機(jī)分為2組，其中一組為試驗(yàn)組，飼料中添加200 g/d劑量的葡萄糖［15］，每天3次，促進(jìn)其體內(nèi)胰島素的分泌。另一組作為對(duì)照組。所有供試豬嚴(yán)格按照商品豬的飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)。飼喂3周后進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，屠宰前停飼24 h。屠宰前抽取每頭豬20m L靜脈血，4℃、3 000 r/min離心15 min，分離得到的血清立即凍于液氮中待測(cè)激素含量。屠宰后30 min內(nèi)采集每頭豬的子宮組織，樣品剪成黃豆大小，立即凍存于液氮中待測(cè)其繁殖相關(guān)基因表達(dá)量。

1.2 試劑

葡萄糖以及實(shí)時(shí)定量PCR所用引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；胰島素、雌激素、孕激素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司；TRIZOL試劑和PrimeScriptTMRTPCR試劑盒購(gòu)自英杰生命技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)和PCR儀購(gòu)自艾本德股份公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Implen公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自羅氏公司。

1.4 激素水平測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書使用酶聯(lián)免疫分析血清中的胰島素、雌激素和孕酮含量。

1.5 總RNA的提取及cDNA的合成

使用TRIZOL試劑提取子宮組織的總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量，然后使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA的濃度。稀釋為同一濃度后，使用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒合成cDNA。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)繁殖相關(guān)基因表達(dá)變化

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)基因信息，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量分析的引物，包括雌激素受體（estrogen receptor 1，ESR）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、視黃醇結(jié)合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）、黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）、孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、KISS1受體（KISS1 receptor，GPR54）等6個(gè)繁殖性狀相關(guān)的基因，具體引物信息見(jiàn)表1。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行定量PCR分析。擴(kuò)增體系包含cDNA 2μg，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，2×SYBR Ex TaqⅡ12.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃3 m in；95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件完成激素和基因表達(dá)差異的顯著性檢測(cè)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加葡萄糖對(duì)相關(guān)激素的影響

添加葡萄糖極顯著改變胰島素、雌激素和孕酮的表達(dá)量（表2）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組胰島素上調(diào)了4.76倍，孕酮表達(dá)量變化最大，上調(diào)了4.93倍，雌激素上調(diào)倍數(shù)最低，為1.74倍。

2.2 添加葡萄糖對(duì)繁殖相關(guān)基因表達(dá)量的影響

添加葡萄糖對(duì)所選的6個(gè)繁殖相關(guān)基因的表達(dá)量均有影響，與對(duì)照組相比，僅LHR基因表達(dá)量下調(diào)（試驗(yàn)組和對(duì)照組差異不顯著），ESR、OPN、GPR54、PGR和RBP4基因表達(dá)量均上調(diào)。其中，ESR表達(dá)量變化最大，添加葡萄糖其表達(dá)量上調(diào)5.056倍（P＜0.01），RBP4基因上調(diào)倍數(shù)最少，上調(diào)2.108倍（P＜0.05）（圖1）。

ESR基因存在于母豬子宮、陰道等多種靶組織中，對(duì)其雌激素發(fā)揮作用具有關(guān)鍵作用［16］。ESR對(duì)母豬繁殖周期的維持以及繁殖力的調(diào)控起重要作用，是調(diào)控母豬產(chǎn)仔數(shù)的主效基因［17］。通過(guò)PCRRFLP分析，ESR基因?qū)ξ覈?guó)地方品種母豬產(chǎn)仔數(shù)均有極顯著影響，不同基因型母豬每胎產(chǎn)仔數(shù)差異1.40～3.37頭，而每胎產(chǎn)活仔數(shù)差異0.63～3.58頭［18］。本研究中，添加葡萄糖后，后備母豬血清中胰島素和雌激素含量極顯著升高（P＜0.01），其子宮ESR基因表達(dá)量也極顯著升高（P＜0.01），提示添加葡萄糖可以通過(guò)促進(jìn)胰島素的分泌調(diào)控后備母豬的繁殖性能。

OPN編碼一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，即骨橋蛋白，是子宮分泌的非常重要的蛋白質(zhì)。骨橋蛋白能夠增強(qiáng)細(xì)胞之間的粘合和信號(hào)傳遞，其在胚胎著床、胎盤形成以及維持妊娠方面起著關(guān)鍵作用［19］。豬OPN基因表達(dá)量隨著妊娠期過(guò)程增加，在妊娠期85 d其表達(dá)量最高，其表達(dá)量與孕激素對(duì)豬子宮內(nèi)膜的調(diào)控規(guī)律一致，提示其表達(dá)量受孕激素的調(diào)控［20-21］。研究表明，向大白豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞添加不同濃度的雌激素和孕激素，發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)OPN具有明顯的抑制作用，而孕激素明顯促進(jìn)OPN的表達(dá)，因?yàn)镺PN基因上游調(diào)控區(qū)包含孕激素調(diào)控元件（PRE）［22］。本研究中，在后備母豬飼料中添加葡萄糖后，其雌激素和孕激素表達(dá)量均顯著上調(diào)，但是孕激素的上調(diào)幅度（4.90倍）高于雌激素的上調(diào)幅度（1.74倍），所以孕激素對(duì)OPN的促進(jìn)作用比雌激素對(duì)OPN的抑制效果更明顯，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與此結(jié)果相符，添加葡萄糖后OPN基因表達(dá)量極顯著增高。

在豬、牛等動(dòng)物整個(gè)發(fā)情期子宮內(nèi)都有LHR的表達(dá)，其表達(dá)量在黃體期最高［23］。研究表明，LHR mRNA在濟(jì)寧青山羊整個(gè)發(fā)情周期的子宮中都有表達(dá)，在發(fā)情期表達(dá)量最低，在間情期逐漸升到最高值［24］。本研究中，后備母豬飼料中添加葡萄糖對(duì)其子宮LHR基因表達(dá)影響并不顯著，可能與選取的子宮組織有關(guān)，下一步可檢測(cè)該基因在卵巢表達(dá)量的變化。

基于本研究結(jié)果，可以用葡萄糖代替各種鉻制劑刺激后備母豬胰島素上調(diào)，促進(jìn)其繁殖相關(guān)激素分泌及基因表達(dá)，影響后備母豬的卵泡發(fā)育、發(fā)情等性狀。葡萄糖對(duì)動(dòng)物和人沒(méi)有直接危害，可以避免鉻制劑帶來(lái)的重金屬污染，下一步試驗(yàn)需要精確驗(yàn)證葡萄糖的添加時(shí)間及劑量，將成本降低到最小。

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Effects of Glucose on the Expression of Genes Related to Reproduction in Replacement Gilts

WANG Jing1，ZHANG Jiaqing1，BAIXianxiao1，GAO Binwen1，CHEN Junfeng1，ZHANG Bin1，GUO Zilin1，WANG Huashuai2，XING Baosong1*
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.Henan Xing Rui Agricultural and Animal Husbandry Technology Co.，Ltd，Xinyang 465550，China）

In order to investigate the feasibility of regulating the reproductive performance of the replacement gilts with glucose instead of chromium，six 70—80 kg Yorkshire replacement gilts were random ly allocated to experimental group and control group.During the 21-day research，glucose was addded to the meal diets of the experimental groups（200 g/d）.It was found that the addition of glucose significantly promoted the serum insulin，progesterone and estrogen by ELISA analysis.And qRT-PCR showed that the expression of the estrogen receptor 1（ESR），osteopontin（OPN），KISS1 receptor（GPR54），progesterone receptor（PGR），retinol binding protein 4（RBP4）were significantly up-regulated by the adding of glucose.These results suggested thatwe could use glucose instead of chromium to stimulatethe insulin secretion，and to achieve the purpose of improving reproductive performance of rep lacement gilts.

rep lacement gilts；insulin；reproductive traits；gene expression；glucose

Q78；S828

A

1004-3268（2017）01-0140-04

2016-07-10

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（162300410143）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2015ZZ34）作者簡(jiǎn)介：王 璟（1985-），女，陜西潼關(guān)人，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究工作。E-mail：wangjing-0407@163.com

*通訊作者：邢寶松（1969-），男，河南新密人，副研究員，博士，主要從事豬的育種與管理研究工作。